Выделение иммуноглобулинов G (IgG) из антисыворотки и проведение ингибиторного анализа
Страница 1

Полученные антитела к АТФ-чувствительному К+-транспортирующему белку с м.м. 55 кДа, выделенному из МХ печени крысы, использовали в качестве ингибитора АТФ-зависимого транспорта ионов калия в МХ печени крысы. Для этого, полученные очищенные и концентрированные антитела (иммуноглобулины G (IgG)) кроликов (см. «Материалы и методы»). Контролем служили очищенные IgG сыворотки крови Интактных (неиммунизированных) кроликов. Кроме того, в качестве контроля использовались антитела к белку с м.м. 55 кДа, подвергнутые кипячению в течение 5 минут. Ранее было показано, что такая процедура ведет к потере белком активности. IgG контрольных животных получали тем же способом, что и IgG рабочей сыворотки. В ходе выделения и очистки IgG титр антител и сродство к белку-каналу с м.м. 55 кДа существенно не изменяется. Степень чистоты выделенных из сыворотки IgG определяли методом ДДС-ПААГ электрофореза [Laemmli, 1979] (см. «Материалы и методы»).

Очищенные фракции IgG, выделенные из иммунизированных и интактных животных, использовали для ингибирования АТФ-зависимого выхода ионов К+ из МХ в присутствии ДНФ, отражающего работу митоКАТФ, и энергозависимого входа ионов К+ в МХ. Все эксперименты проводились при термостатировании (26°С) и постоянном перемешивании. После 1.5-2 минут преинкубации антител с митохондриями транспорт ионов К+ индуцировали ДНФ (при исследовании выхода К+ из МХ К+-селективным электродом) или субстратом дыхания (при определении энергозависимого входа К+ в МХ). Для повышения эффективности взаимодействия IgG с внутренней мембраной МХ создавались гипотонические условия. На рисунке 6 представлена концентрационная зависимость степени ингибирования выхода ионов К+ из МХ печени крысы в присутствии разобщителя (ДНФ). Ингибирующий эффект антител наблюдается только в случае добавления в среду инкубации МХ очищенных интактных IgG к АТФ-зависимому К+-транспортирующему белку с м.м. 55 кДа, выделенному из печени крысы. Степень ингибирования зависела от концентрации IgG и времени преинкубации.

Рисунок 18. Ингибирование АТФ-зависимого ДНФ-индуцированного выхода К+ из МХ печени крысы антителами на АТФ-чувствительный К+ белок-канал с м.м. 55 кДа. Кi = 0.170+0.07 мг IgG/мг белка МХ

Максимальное ингибирование, наблюдавшееся в данных экспериментах составляло 83%. Константа полумаксимального ингибирования (Кi) составила 0.170+0.07 мг IgG/мг белка МХ (Рис. 20).

Антитела к белку с м.м. 55 кДа, выделенному из МХ печени крысы, ингибируют также энергозависимый вход ионов К+ (Рис. 21).

Рисунок 19. Ингибирование энергозависимого входа ионов К+ в МХ печени крысы антителами на белок с м.м. 55 кДа

Следует отметить, что IgG контрольной сыворотки и IgG, инактивированные кипячением, не влияли ни на ДНФ-индуцированный выход калия из МХ, ни на энергозависимый вход ионов (Таблица 9). Кроме того, антитела, полученные на АТФ-зависимый К+-транспортирующий белок с м.м. 55 кДа, выделенный из МХ печени крысы, не блокировали АТФ-чувствительный К+ транспорт в МХ сердца крысы, при использовании обоих методов исследования (Таблица 9).

Страницы: 1 2


Рекомендуем к прочтению:

Конструирование рекомбинантных молекул ДНК
Непосредственное конструирование рекомбинантных молекул ДНК следует после того, как получены рестрикты исследуемой ДНК и векторной ДНК. Оно заключается в смыкании сегментов-рест-риктов исследуемой ДНК с рестриктом векторной ДНК, которая в ...

Фосфолипиды нейронов и нейроглии
Биохимические процессы, отвечающие за метаболическое единство системы нейрон-нейроглия, протекают на уровне их плазматических мембран. В связи с этим исследование мембранных компонентов нейрональных и нейроглиальных клеток приобретает пер ...

Получение ацетона и бутанола в ходе бактериального брожения представителей рода Сlostridium
Ацетон и бутанол – единственные важные химические вещества, которые в больших количествах получают путем бактериального брожения. Ацетоно-бутиловое брожение вызывают бактерии рода Сlostridium, а именно С lostridium acetobutylicum и друг ...