Определение специфичности полученных антител

Специфичность антител на белок с м.м. 55 кДа определяли методом Вестерн-блот. Для этого выделенный из МХ печени крысы и очищенный АТФ-чувствительный К+-транспортирующий белок с м.м. 55 кДа наносили на ДДС-ПААГ электрофорез с 10%-ым ПААГ гелем с нагрузкой на полосу 10 мкг. На другую полосу наносили 10 мкг тотальной белковой фракции МХ. Порядок нанесения образцов дублировался на том же геле. После электрофоретического разделения белков половина геля, содержащая оба образца и стандарт молекулярных масс, окрашивалась серебрением [Shevchenko et al., 1996]. Вторая половина использовалась для переноса на нитроцеллюлозную мембрану с последующей обработкой полученными антителами (п.п. 5.2.2. «Материалов и методов»). При этом исследуемую антисыворотку разводили 1:300, вторичные антитела – 1:500.

1 2 3

1 2

А

Б

Рисунок 17. А. ДСН-электрофорез фракций

1 – очищенный АТФ-чувствительный К+-транспортирующий белок с м.м. 55 кДа, 2 – молекулярные стандарты массы белков, 3 – суммарный белок МХ. Б. Вестерн-блот анализ: 1 – очищенный АТФ-чувствительный К+-транспортирующий белок с м.м. 55 кДа, 2 – суммарный белок МХ.

Показано, что полученные в работе антитела специфически связываются только с белком с м.м. 55 кДа, и не вязываются ни с одним из массы белков, находящихся в МХ (Рис.19). Таким образом, в работе были получены специфические поликлональные антитела на белок с м.м. 55 кДа.

Этим же методом было установлено, что поликлональные антитела на исследуемый белок-канал, полученный из МХ печени крысы, не взаимодействует с той же концентрацией аналогичного белка с м.м. 55 кДа, выделенного тем же методом из МХ сердца крысы. Данный факт указывает на то, что исследуемый белок с м.м. 55 кДа тканеспецифичен.


Рекомендуем к прочтению:

Тиоловая прогормон-конвертаза
Прогормон тиоловая протеаза – тиоловая эндопептидаза секреторных везикул, расщепляющая пептидные субстраты по моно- и диосновным сайтам процессинга с обеих сторон (N- и C-) . Представляет собой одноцепочечный кДа гликопротеин с pI, и опти ...

Современные взгляды на структурную организацию материи
В классическом естествознании учение о принципах структурной организации материи было представлено классическим атомизмом. Идеи атомизма служили фундаментом для синтеза всех знаний о природе. В XX веке классический атомизм подвергся радик ...

Структура и ее роль в организации живых систем. Система и целое
Система — это комплекс элементов, находящихся во взаимодействии. В переводе с греческого это целое, составленное из частей, соединение. Претерпев длительную историческую эволюцию, понятие система с середины XX в. становится одним из ключ ...