Определение специфичности полученных антител

Специфичность антител на белок с м.м. 55 кДа определяли методом Вестерн-блот. Для этого выделенный из МХ печени крысы и очищенный АТФ-чувствительный К+-транспортирующий белок с м.м. 55 кДа наносили на ДДС-ПААГ электрофорез с 10%-ым ПААГ гелем с нагрузкой на полосу 10 мкг. На другую полосу наносили 10 мкг тотальной белковой фракции МХ. Порядок нанесения образцов дублировался на том же геле. После электрофоретического разделения белков половина геля, содержащая оба образца и стандарт молекулярных масс, окрашивалась серебрением [Shevchenko et al., 1996]. Вторая половина использовалась для переноса на нитроцеллюлозную мембрану с последующей обработкой полученными антителами (п.п. 5.2.2. «Материалов и методов»). При этом исследуемую антисыворотку разводили 1:300, вторичные антитела – 1:500.

1 2 3

1 2

А

Б

Рисунок 17. А. ДСН-электрофорез фракций

1 – очищенный АТФ-чувствительный К+-транспортирующий белок с м.м. 55 кДа, 2 – молекулярные стандарты массы белков, 3 – суммарный белок МХ. Б. Вестерн-блот анализ: 1 – очищенный АТФ-чувствительный К+-транспортирующий белок с м.м. 55 кДа, 2 – суммарный белок МХ.

Показано, что полученные в работе антитела специфически связываются только с белком с м.м. 55 кДа, и не вязываются ни с одним из массы белков, находящихся в МХ (Рис.19). Таким образом, в работе были получены специфические поликлональные антитела на белок с м.м. 55 кДа.

Этим же методом было установлено, что поликлональные антитела на исследуемый белок-канал, полученный из МХ печени крысы, не взаимодействует с той же концентрацией аналогичного белка с м.м. 55 кДа, выделенного тем же методом из МХ сердца крысы. Данный факт указывает на то, что исследуемый белок с м.м. 55 кДа тканеспецифичен.


Рекомендуем к прочтению:

Изучение уровней включения изотопов 2Н- и 13С в аминокислоты суммарных белков метилотрофных бактерий.
2Н- и 13С-меченные аминокислоты в составе гидролизатов белка биомассы были получены в условиях, аналогичных таковым для секретируемых аминокислот (табл. 4). Хотя в таблице 4 приведены данные только для 10 аминокислот, не вызывает сомнения ...

Выявление мезофильных анаэробных микроорганизмов (ГОСТ 10444.4)
Метод предназначен для определения стерильности и промышленной стерильности консервов, для выяснения причин возникновения дефектов консервов. Проведение анализа. Для выявления анаэробных микроорганизмов посев производится в две пробирки ...

Численности и динамика численности
В большинстве сезонов лисица по численности в 2–5 раз превосходит корсака. Численность лисицы в 1980–1993 гг. на охваченной учетом площади в 4,2 млн. га колебалась в пределах 1600–5800 особей. Однако в последние годы из-за отсутствия спро ...