Определение степени чистоты белка, используемого для иммунизации
Страница 1

Для получения поликлональных специфических антител на белок-канал необходимо было получить гомогенный белок с м.м. 55 кДа. Этот белок выделяли из МХ печени крысы методом водно-этанольной экстракции [Миронова и др., 1981; 1996(I)]. Дальнейшую очистку белка проводили методом ионообменной хроматографии с использованием ДЭАЭ-целлюлозы (п.п. 2 «Материалов и методов»). Каналообразующий белок элюировался с колонки 250 мМ KCl. Чистота данной фракции определялась ДДС-ПААГ электрофорезом [Laemmli, 1979] (Рис.5). Для обнаружения активной фракции, все фракции, элюированные с колонки ДЭАЭ-целлюлозы тестировали при встраивании в БЛМ (см. «Материалы и методы»). Далее активную фракцию (250 мМ KCl) диализовали против 5 мМ Трис буфера (pH 7.2) с добавлением 0.1% b-меркаптоэтанола в течение ночи при 4°С. Диализат повторно наносили на колонку ДЭАЭ-целлюлозы, аналогичную использовавшейся в первом случае. Фракции элюировали ступенчатым градиентом KCl. Все фракции тестировались на активность при встраивании в БЛМ. АТФ-ингибируемые К+-селективные каналы формировались, как правило, при встраивании белка, элюированного 250 мМ KCl.

Дополнительная очистка проводилась методом препаративного нативного электрофореза (п.п. 5.1.1. «Материалов и методов») в 10%-ом ПААГ. На конечной стадии очистки, исследуемый белок элюировали из геля, концентрировали методом обратного диализа на ПЭГ и проверяли на ДДС-ПААГ электрофорезе (Рис.17). Электрофоретическая подвижность белка соответствовала массе ~55 кДа.

2

1

42 кДа

55 кДа

67 кДа

97 кДа

Страницы: 1 2


Рекомендуем к прочтению:

Выявление возбудителей брожения целлюлозы
Постановка опыта. Для получения накопительной культуры целлюлозоразрушающих бактерий используют среду Омелянского (приложение). В высокие пробирки на 2/3 заливают среду Омелянского, добавляют 1 г исследуемой почвы, затем пастеризуют 10 м ...

Трансдукция механических стимулов
Очевидно, что должны существовать чувствительные к растяжению ионные каналы, расположенные на механочувствительных нервных окончаниях, где генерируется рецепторный потенциал. Более того, эти каналы трансдукции должны отличаться от каналов ...

Особенности игровой деятельности человека
Игра, по мнению большинства исследователей, является ведущим видом деятельности для ребенка первых лет жизни. В целом она выполняет те же функции, что и у животных, а именно – развивающую, познавательную, функцию социализации и др. Отлич ...