Определение степени чистоты белка, используемого для иммунизации
Страница 1

Для получения поликлональных специфических антител на белок-канал необходимо было получить гомогенный белок с м.м. 55 кДа. Этот белок выделяли из МХ печени крысы методом водно-этанольной экстракции [Миронова и др., 1981; 1996(I)]. Дальнейшую очистку белка проводили методом ионообменной хроматографии с использованием ДЭАЭ-целлюлозы (п.п. 2 «Материалов и методов»). Каналообразующий белок элюировался с колонки 250 мМ KCl. Чистота данной фракции определялась ДДС-ПААГ электрофорезом [Laemmli, 1979] (Рис.5). Для обнаружения активной фракции, все фракции, элюированные с колонки ДЭАЭ-целлюлозы тестировали при встраивании в БЛМ (см. «Материалы и методы»). Далее активную фракцию (250 мМ KCl) диализовали против 5 мМ Трис буфера (pH 7.2) с добавлением 0.1% b-меркаптоэтанола в течение ночи при 4°С. Диализат повторно наносили на колонку ДЭАЭ-целлюлозы, аналогичную использовавшейся в первом случае. Фракции элюировали ступенчатым градиентом KCl. Все фракции тестировались на активность при встраивании в БЛМ. АТФ-ингибируемые К+-селективные каналы формировались, как правило, при встраивании белка, элюированного 250 мМ KCl.

Дополнительная очистка проводилась методом препаративного нативного электрофореза (п.п. 5.1.1. «Материалов и методов») в 10%-ом ПААГ. На конечной стадии очистки, исследуемый белок элюировали из геля, концентрировали методом обратного диализа на ПЭГ и проверяли на ДДС-ПААГ электрофорезе (Рис.17). Электрофоретическая подвижность белка соответствовала массе ~55 кДа.

2

1

42 кДа

55 кДа

67 кДа

97 кДа

Страницы: 1 2


Рекомендуем к прочтению:

Питание человека
Энергия химических связей веществ пищи — жиров, углеводов и белков и некоторых других — обеспечивает энергетические потребности организма человека. Современные представления о питании человека нашли отражение в теории. Пища — фактор, обе ...

Ферментативные системы нейронов и нейроглии
Особенности протекания метаболических процессов в нейрональных и нейроглиальных клетках наиболее отчетливо проявляются при изучении активности ферментных систем, под контролем которых они находятся. Ранние работы по исследованию активност ...

Новые опыты и проверки
Наступили беспокойные для Рентгена дни. Он все еще не был уверен в том, что его наблюдения верны. А что если все это ему только показалось? Что если оп поддался оптическому обману, самовнушению? Действительно ли лучи икс существуют? Дол ...