Определение гомологии белка с м.м. 55 кДа методом MS-MALDI-TOF/TOF
Страница 1

Первым этапом изучения белка с м.м. 55 кДа было определение гомологичности его структуры последовательностям известных белков. Для этого электрофоретически чистый белок исследовали MS-MALDI-TOF/TOF (от англ. mass spectrometry-matrix assisted laser desorbtion/ionization – time of flight/time of flight) анализом.

Согласно данным, полученным MS-MALDI-TOF/TOF анализом, белок с м.м. 55 кДа на 54% гомологичен белку-предшественнику, который, исходя из результатов анализа базы данных NCBI (программное обеспечение - MASCOT (MartixScience, Москва)), является предшественником кальретикулина. Вероятно, белок с м.м. 55 кДа является конечным продуктом систем посттрансляционной модификации данного белка-предшественника. На рисунке 14 представлена аминокислотная последовательность белка-предшественника. Последовательности данного белка, перекрывающиеся с последовательностями 55 кДа белка, выделены серым цветом.

1 MLLSVPLLLG LLGLAAADPA IYFKEQFLDG DAWTNRWVES KHKSDFGKFV

51 LSSGKFYGDQ EKDKGLQTSQ DARFYALSAR FEPFSNKGQT LVVQFTVKHE

101 QNIDCGGGYV KLFPGGLDQK DMHGDSEYNI MFGPDICGPG TKKVHVIFNY

151 KGKNVLINKD IRCKDDEFTH LYTLIVRPDN TYEVKIDNSQ VESGSLEDDW

201 DFLPPKKIKD PDAAKPEDWD ERAKIDDPTD SKPEDWDKPE HIPDPDAKKP

251 EDWDEEMDGE WEPPVIQNPE YKGEWKPRQI DNPDYKGTWI HPEIDNPEYS

301 PDANIYAYDS FAVLGLDLWQ VKSGTIFDNF LITNDEAYAE EFGNETWGVT

351 KAAEKQMKDK QDEEQRLKEE EEDKKRKEEE EAEDKEDEDD RDEDEDEEDE

401 KEEDEEDATG QAKDEL

Рис.12. Аминокислотная последовательность прекурсорного белка. Участки структуры белка-предшественника, совпадающие с последовательностями, имеющимися в белке с м.м. 55 кДа, выделены серым цветом

При рассмотрении структуры типичного кальретикулина, выделенного из печени крысы, процент перекрывания его аминокислотных последовательностей с известными последовательностями 55 кДа белка также оказался достаточно большим (Рис.13).

1 mllsvplllg llglaaadpa iyfkeqfldg dawtnrwves khksdfgkfv

51 lssgkfygdq ekdkglqtsq darfyalsar fepfsnkgqt lvvqftvkhe

101 qnidcgggyv klfpggldqk dmhgdseyni mfgpdicgpg tkkvhvifny

151 kgknvlinkd irckddefth lytlivrpdn tyevkidnsq vesgsleddw

201 dflppkkikd pdaakpedwd erakiddptd skpedwdkpe hipdpdakkp

251 edwdeemdge weppviqnpe ykgewkprqi dnpdykgtwi hpeidnpeys

301 pdaniyayds favlgldlwq vksgtifdnf litndeayae efgnetwgvt

351 kaaekqmkdk qdeeqrlkee eedkkrkeee eaedkededd rdededeede

401 keedeedatg qakdel

Рисунок 13. Аминокислотная последовательность типичного кальретикулина (21-332 – кальретикулин, 1-17 – сигнальная последовательность, удаляемая протеолизом при созревании белка). Участки последовательности, общие с белком с м.м. 55 кДа, выделены серым цветом

Классический кальретикулин входит в состав семейства высококонсервативных белков с м.м. около 55 кДа, локализующихся как в саркоплазматическом, так и в эндоплазматическом ретикулуме клеток печени, скелетной и гладкой мускулатуры, сердечной мышцы [Fliegel et al., 1989]. Белки этого семейства связывают ионы кальция, цинка, других металлов, сахара, нуклеотидфосфаты, в частности, УДФ. Они также выступают в роли шаперонных белков в процессе фолдинга, участвуют в системе белковой машинерии, регуляции апоптоза, мейоза, экспорта белков из ядра клетки. Известны гомологи гена кальретикулина у мыши, крысы и человека. У крысы гомологичный ген кальретикулина локализован в 19 хромосоме. При этом ранее в нашей лаборатории было показано, что при окрашивании белков в геле после ДДС-ПААГ электрофореза по Шиффу, исследуемый белок с м.м. 55 кДа давал положительную реакцию, что говорит о способности его связывать сахара [неопубликованные данные]. Кроме того, определялось также и сродство белка-канала к кальцию с использованием 45Ca [неопубликованые данные]. Было показано, что исследуемый белок с м.м. 55 кДа проявляет достаточно большое сродство к этому иону. Эти результаты согласуются с данными по взаимодействию кальретикулина с сахарами и кальцием.

Причем, необходимо заметить, что большая часть перекрывающейся последовательности приходится на Р-домен кальрегулина, способного связывать нуклеотиды. Также, в перекрывающуюся последовательность включены высоконсервативные остатки триптофана, характерные для кальрегулинов в данных сайтах первичной последовательности, и стерически идентично расположенные в первичной аминокислотной последовательности кальрегулина консервативные антипараллельные бета-листы, формирующие Р-домен.

Страницы: 1 2


Рекомендуем к прочтению:

Отличие живого от неживого
Мир живых существ, включая человека, представлен биологическими системами различной структурной организации и разного уровня соподчинения, или согласованности. Из курса ботаники и зоологии известно, что все живые организмы состоят из клет ...

Цитоскелет
В принципе как трансмембранное, так и латеральное распределение мембранных компонентов может зависеть от их взаимодействия со структурами, находящимися на поверхности мембраны. В ряде случаев такая зависимость была четко выявлена, в частн ...

Классическая механика – фундамент естественнонаучной теории
Классическая механика была первой фундаментальной естественнонаучной теорией. В течение трех столетий (с ХVII в. по начало ХХ в.) она выступала единственным теоретическим основанием физического познания, а также ядром второй естественнона ...