Иммунноэлектронная микроскопия

Ткань печени и сердца фиксировали в 4%-ном растворе параформальдегид/0.05% глутаровый альдегид в PBS – буфере (16.7 мМ Na2HPO4· 12 H2O, 3.3 мМ KH2PO4, 150 мМ NaCl, рН 7,4) в течение 4 ч при 4°С. Обезвоживание в спиртах и пропитку образца смолой LR-White (Sigma, USA) проводили при 4°С. Полимеризацию смолы осуществляли под ультрафиолетом в течение 48 часов при комнатной температуре. Ультратонкие срезы готовили на ультратоме UC6 (Leica, Германия) и помещали на золотые сеточки, покрытые формваровой пленкой и укрепленные углем (Agar). Неспецифическое окрашивание блокировали обработкой раствором, содержащим 3% БСА и 0.5% желатина в течение 1ч. Все дальнейшие процедуры проводили в PBS содержащем 1% БСА и 0.01% тритон Х-100. После каждой инкубации образцы отмывали PBS- буфером, содержащим 0.1% тритон Х-100 и 0.1% глицин и затем в растворе БСА и желатина в течение 20 мин [18]. В качестве первичных антител были использованы полученные нами антитела к митохондриальному К+-транспортирующему белку (в разведении 1:100), инкубацию с которыми проводили в течение ночи при 4°С. После тщательной отмывки сеточки с образцами помещали на каплю вторичных антител, меченных коллоидным золотом с размером гранул 10 нм (Anti-Rabbit IgG, Sigma, USA) и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре. После отмывки образцы окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца и просматривали под электронным микроскопом Tesla BS-500 (Чехословакия). Специфичность метода проверяли заменой первичных антител на буфер.


Рекомендуем к прочтению:

Определение уровня инсулина
Уровень инсулина определяли иммуноферментным методом ELISA [23] в сыворотке крови. Для получения сыворотки кровь центрифугировали 30 мин при 4000 об/мин. ...

Строение клетки.
Клетка как целостная живая система. Клетка - это мельчайшая единица жизни, которая характеризуется определенным типом обмена веществ, самостоятельным энергетическим циклом и способностью к саморегуляции. Клетка - это открытая термодинам ...

Человеческое бытиё.
Человек действует среди вещей как нечто отличное от вещности. Со времён Декарта мы усвоили отличие res extensa (вещей протяжённых) от res cogitas (вещей мыслящих). Хотя человек и “обладает” протяжённым вещественным телом, но, как представ ...