Вестерн-Блот анализ

Данный метод, впервые описанный Товбином и соавторами [Towbin et al., 1979] использовали для идентификации АТФ-зависимого К+-транспортирующего белка с м.м. 55 кДа в различных тканях животных.

На первом этапе проводили фракционирование МХ с помощью SDS-PAAG электрофореза [Laemmli, 1979]. Нагрузка составляла 5 мкг суммарного белка. Электрофорез вели при комнатной температуре и постоянном токе (20-30 мА на пластину) в течение 3-4 часов до достижения бромфеноловым синим нижнего фронта геля.

После электрофореза половину геля окрашивали Кумасси R-250 или серебрением [Shevchenko et al., 1996], а вторую половину уравновешивали в буфере для блоттинга (150 мМ глицина, 20 мМ Триса, 0.02 % ДСН, 20 % метанол, рН 8.3) в течение 30 минут на качалке при комнатной температуре. Затем гель покрывали нитроцеллюлозной мембраной (Sigma, диаметр пор 0.45 мкм) и помещали между листами влажной фильтровальной бумаги. Систему помещали между двумя пористыми прокладками и зажимали между двумя пластинами из плексигласа. Перенос вели при напряженности 7 В/см2 в течение двух часов при комнатной температуре. После окончания переноса нитроцеллозную мембрану инкубировали в течение 30 минут в ПБС-Твин буфере при комнатной температуре. Дальнейшая процедура такая же, как в п.п. 5.2.1.


Рекомендуем к прочтению:

Современная ойкумена. Ноосфера
Под ойкуменой понимается часть планеты, населенная человеком. В этом понимании термин "ойкумена" впервые был употреблен древнегреческим географом Гекатеем Милетским (около 546-480 до н.э.) в его "Землеописании". Незасе ...

Соли в организме
В теле человека до 3 кг минеральных солей, из которых 5/6 находится в костях. В общем солевом обмене значительный удельный вес занимает поваренная соль. В организме взрослого человека ее около 300 г. Соль известна человеку с незапамятных ...

Общая характеристика нервной ткани
Нервная ткань(textus nervosus) — это высокоспециализированный вид ткани. Состоит нервная ткань из двух компонентов: нервных клеток (нейронов или нейроцитов) и нейроглии. Последняя занимает все промежутки между нервными клетками. Нервные к ...