Детекция специфических антител и определение титра

Для определения титра полученных антител использовали белок с м.м. 55 кДа, полученный по схеме, описанной в п.п. 5.1.1. Белок в 10 мМ Трис-HCl, рН 7.4, в концентрации 1-2 мкг/мкл сорбировали на полосы нитроцеллюлозной мембраны, в количестве равном числу разведений первичных антител, подсушивали. Затем полоски нитроцеллюлозы инкубировали в ПБС-Твин буфере (0.15 М NaCl, 0.02 М NaH2PO4 × 12 Н2О, рН 7.4, 0.1% Твин-20) в течение 30 минут при комнатной температуре. После этого мембраны в течение часа инкубировали с ПБС-Твин-молоко буфером (ПБС-Твин 20 + 2% сухого молока (Amersham, Германия)) чтобы заблокировать участки, неспецифичного связывания с белком.

Буфер для блокирования удаляли и мембраны последовательно инкубировали сначала с первичными специфическими кроличьими антикрысиными антителами, а затем с вторичными антителами (козьи антикроличьи, Sigma), по 1 часу, отмывая мембрану ПБС-Твин-молоко буфере (смена буфера 4-5 раз в течение часа). При этом делали несколько разведений антисыворотки (1:400, 1:800, 1:1600, 1:3200, 1:6400, 1:12800, 1:25600, 1:51200) в ПБС-Твин-молоко буфере. Каждую полоску нитроцеллюлозной мембраны с белком помещали в отдельную емкость и инкубировали с антителами определенного разведения. Разведение вторичных антител – 1:500.

Перед окрашиванием полосы мембран тщательно отмывали в ПБС-Твин буфере (4-5 смен буфера в течение 30-40 минут). Окрашивание проводили пероксидазной реакцией в присутствии 0.02% перекиси водорода. Буфер для окрашивания содержал 50 мМ Трис-HCl, рН 7.5. Через 2-5 минут реакцию останавливали, промывая мембрану дистиллированной водой. Затем мембрану высушивали и хранили в темноте.


Рекомендуем к прочтению:

Синтез митохондриальных белков
В митохондриях клеток высших организмов содержится до 2% клеточной ДНК, отличающейся от ДНК ядра. Митохондрии содержат весь аппарат, включая рибосомы, тРНК и мРН К, необходимый для синтеза определенных белков. Синтезируемые в митохондриях ...

Классификация белков
Сложность строения белковых молекул, чрезвычайное разнообразие выполняемых ими функций затрудняют создание единой и четкой их классификации, хотя попытки сделать это предпринимались неоднократно, начиная с конца 19 века. Исходя из химичес ...

Семейство Мышовковые (Zapodidae)
В это семейство выделяются мелкие, внешне похожие на мышей грызуны, главное отличие которых от мышей заключается в числе верхних коренных зубов: почти у всех мышовковых их с каждой стороны верхней челюсти по 4 (в нижней челюсти, как у мыш ...