Детекция специфических антител и определение титра

Для определения титра полученных антител использовали белок с м.м. 55 кДа, полученный по схеме, описанной в п.п. 5.1.1. Белок в 10 мМ Трис-HCl, рН 7.4, в концентрации 1-2 мкг/мкл сорбировали на полосы нитроцеллюлозной мембраны, в количестве равном числу разведений первичных антител, подсушивали. Затем полоски нитроцеллюлозы инкубировали в ПБС-Твин буфере (0.15 М NaCl, 0.02 М NaH2PO4 × 12 Н2О, рН 7.4, 0.1% Твин-20) в течение 30 минут при комнатной температуре. После этого мембраны в течение часа инкубировали с ПБС-Твин-молоко буфером (ПБС-Твин 20 + 2% сухого молока (Amersham, Германия)) чтобы заблокировать участки, неспецифичного связывания с белком.

Буфер для блокирования удаляли и мембраны последовательно инкубировали сначала с первичными специфическими кроличьими антикрысиными антителами, а затем с вторичными антителами (козьи антикроличьи, Sigma), по 1 часу, отмывая мембрану ПБС-Твин-молоко буфере (смена буфера 4-5 раз в течение часа). При этом делали несколько разведений антисыворотки (1:400, 1:800, 1:1600, 1:3200, 1:6400, 1:12800, 1:25600, 1:51200) в ПБС-Твин-молоко буфере. Каждую полоску нитроцеллюлозной мембраны с белком помещали в отдельную емкость и инкубировали с антителами определенного разведения. Разведение вторичных антител – 1:500.

Перед окрашиванием полосы мембран тщательно отмывали в ПБС-Твин буфере (4-5 смен буфера в течение 30-40 минут). Окрашивание проводили пероксидазной реакцией в присутствии 0.02% перекиси водорода. Буфер для окрашивания содержал 50 мМ Трис-HCl, рН 7.5. Через 2-5 минут реакцию останавливали, промывая мембрану дистиллированной водой. Затем мембрану высушивали и хранили в темноте.


Рекомендуем к прочтению:

Образ жизни и поведение
Активность зависит от времени года, активности их жертв и степени преследования самих хищников человеком. Всюду более активны в прохладную погоду. Хорошо бегает. Волки избегают человека и, как правило, не нападают на него. Но деятельност ...

Сущность процессов, происходящих в желудочно-кишечном тракте
Ежесуточно взрослый человек должен получать около 80—100 г белков, 80—100 г жира и 400 г углеводов. Они поступают с пищей. Вместе с ними в пище содержатся минеральные соли, микроэлементы, витамины, а также балластные вещества, которые явл ...

Обмен веществ
ОБМЕН ВЕЩЕСТВ - это процесс поступления веществ в организм, их переработка, доставка в каждую клетку тела, превращения в клетках с выделением энергии и удаление продуктов распада. В наш организм поступают такие вещества, как кислород и п ...