Получение и очистка антител к белку с молекулярной массой 55 кДа. Подготовка белка с м.м. 55 кДа: выделение и очистка

Биология » Параметры функционирования митоКАТФ у животных с различной устойчивостью к гипоксии, а также у крыс, адаптированных к кислородному голоданию » Получение и очистка антител к белку с молекулярной массой 55 кДа. Подготовка белка с м.м. 55 кДа: выделение и очистка

Выделение и первичная очистка белка проводились методами, описанными в п.п. 2. Белок хранили при температуре -20°С. Фракции, содержавшие белок с м.м. 55 кДа и обладавшие АТФ-ингибируемой К+-селективной активностью, накапливали, затем диализовали против 10 мМ Трис-HCl (рН 7.4) в течение ночи при постоянном перемешивании и температуре 4°С. Обессоленную фракцию концентрировали обратным диализом с использованием полиэтиленгликоля-20000 (ПЭГ) при 4°С. Сконцентрированную фракцию подвергали дополнительной очистке методом нативного электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ). Для электрофореза использовали 10%-ый ПААГ в системе Дэвиса [Davies, 1964]. На геле наблюдалась только одна полоса - белковая зона, в которой определялась АТФ-зависимая К+-транспортирующая активность. Полосу исследуемого белка вырезали из геля, измельчали и элюировали в течение 12 часов при постоянной силе тока (8 мА) и температуре 4°С. Среда элюции содержала 10 мМ Трис-HCl, 38 мМ глицина, рН 8.3. Концентрацию белка в элюате определяли методом Лоури [Лоури, 1951]. Чистоту белка контролировали методом SDS-PAAG электрофореза [Laemmli, 1970]. Выход белка составлял около 30-50 мкг из 100 г ткани печени.

К+-транспортирующие свойства выделенного белка и чувствительность к аденозин-5’-трифосфату оценивали при встраивании его в бислойную липидную мембрану.


Рекомендуем к прочтению:

Жизненный цикл медоносной пчелы
Медоносная пчела родом из тропиков, и еще сейчас там можно обнаружить дикие виды пчел, к числу которых относится карликовая медоносная пчела Apis florea. Эта пчела строит сотовое гнездо, которое висит на открытом воздухе на ветке дерева. ...

Систематика дрожжей
Одноклеточная организация дрожжей накладывает столь существенный отпечаток на их внешний облик и на методы работы с ними, что систематика дрожжей долгое время развивалась вполне независимо от систематики мицелиальных грибов. Одно из важны ...

Микроклональное размножение как способ сохранения редких и исчезающих видов растений
Культура клеток растений – область биологии, тесно связанная с практикой. Почти каждый открытый здесь научный факт находит свое отражение в прикладных исследованиях. В отличие от клеток животных практически любая растительная клетка спосо ...