Выделение и очистка митоКАТФ канала

Солюблизацию КАТФ канала из МХ печени крысы проводили по методу этанольной экстракции, разработанному в нашей лаборатории [Миронова и др., 1981] с некоторыми модификациями. Полученные МХ помещали на 20 мин в гипотонический раствор (концентрация белка составляла 3-4 мг/мл), содержащий 10 мМ Трис-HCl (pH 7,5) при 4° С. Затем экстракт центрифугировали 20 мин при 5500 об/мин. Из полученного осадка митопластов экстрагировали белок. Для этого митопласты разводили 10 мМ Tрис-HCl буфером (рН-7,4) до концентрации 44 мг/мл. К суспензии добавляли 10-кратный водный раствор 66% этанола, охлажденный до -20˚С, и инкубировали при 4˚С в течение 30 минут при постоянном перемешивании. Полученный экстракт центрифугировали при 5500 об/мин в течение 15 минут. Супернатант диализовали против 5 мМ Трис-HCl буфера (рН 7,4) с добавлением 0,05% β-меркаптоэтанола в течение ночи при 4˚С при постоянном перемешивании с одной сменой буфера через 2 часа от начала диализа. Фракцию центрифугировали при 100000 g в ечение 1 часа.

Далее проводили ионообменную хроматографическую очистку полученного экстракта. Носитель - ДЕАЕ-целлюлоза (Sigma), объем колонки - 1 см3, диаметр – 0.5 см, h = 5 см. Скорость колонки - 40 мл/ч. Колонка уравновешивалась буфером, содержавшим 50 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА (рН 7,5). Этим же буфером далее элюировали несвязавшиеся с носителем белки. Связавшиеся белки элюировали двумя объемами ступенчатого градиента KCl (50, 100, 150, 200, 250, 300, 500 мМ KCl). После фракционирования белки каждой фракции идентифицировали методом SDS-PAAG электрофореза (10%). Гели окрашивали Кумасси-R250. Исследуемый белок с м.м. 55 кДа элюировался 250 мМ KCl.


Рекомендуем к прочтению:

Белковый, углеводный, жировой обмен организма человека (поступление веществ, их превращения в пищеварительном тракте и клетках).
ПИТАНИЕ - поступление в организм растений, животных и человека и усвоение ими веществ, необходимых для восполнения энергетических затрат, построения и возобновления тканей. Посредством питания, как составной части обмена веществ, осуществ ...

Жиры
ЖИРЫ - органические соединения, в основном сложные эфиры глицерина и одноосновных жирных кислот (триглицериды); относятся к липидам. Один из основных компонентов клеток и тканей живых организмов. Источник энергии в организме; калорийность ...

Клонирование человека
Клон – это идентичный близнец другого человека, отсроченный во времени. В сущности, речь идет даже не о клонировании, а о получении копии отдельного индивида, поскольку термин «клонирование» предполагает получение некоего множества особей ...