Выделение и очистка митоКАТФ канала

Солюблизацию КАТФ канала из МХ печени крысы проводили по методу этанольной экстракции, разработанному в нашей лаборатории [Миронова и др., 1981] с некоторыми модификациями. Полученные МХ помещали на 20 мин в гипотонический раствор (концентрация белка составляла 3-4 мг/мл), содержащий 10 мМ Трис-HCl (pH 7,5) при 4° С. Затем экстракт центрифугировали 20 мин при 5500 об/мин. Из полученного осадка митопластов экстрагировали белок. Для этого митопласты разводили 10 мМ Tрис-HCl буфером (рН-7,4) до концентрации 44 мг/мл. К суспензии добавляли 10-кратный водный раствор 66% этанола, охлажденный до -20˚С, и инкубировали при 4˚С в течение 30 минут при постоянном перемешивании. Полученный экстракт центрифугировали при 5500 об/мин в течение 15 минут. Супернатант диализовали против 5 мМ Трис-HCl буфера (рН 7,4) с добавлением 0,05% β-меркаптоэтанола в течение ночи при 4˚С при постоянном перемешивании с одной сменой буфера через 2 часа от начала диализа. Фракцию центрифугировали при 100000 g в ечение 1 часа.

Далее проводили ионообменную хроматографическую очистку полученного экстракта. Носитель - ДЕАЕ-целлюлоза (Sigma), объем колонки - 1 см3, диаметр – 0.5 см, h = 5 см. Скорость колонки - 40 мл/ч. Колонка уравновешивалась буфером, содержавшим 50 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА (рН 7,5). Этим же буфером далее элюировали несвязавшиеся с носителем белки. Связавшиеся белки элюировали двумя объемами ступенчатого градиента KCl (50, 100, 150, 200, 250, 300, 500 мМ KCl). После фракционирования белки каждой фракции идентифицировали методом SDS-PAAG электрофореза (10%). Гели окрашивали Кумасси-R250. Исследуемый белок с м.м. 55 кДа элюировался 250 мМ KCl.


Рекомендуем к прочтению:

Дрожжи в современной биотехнологии
Дрожжи как источник белка Использование микробной биомассы для обогащения кормов белком и незаменимыми аминокислотами в условиях интенсивного животноводства - одна из важных проблем будущего, так как человечество развивается таким образо ...

Овогенез
Фазы овогенеза сопоставимы с таковыми при сперматогенезе. В этом процессе также имеется период размножения, когда интенсивно делятся овогонии - мелкие клетки с относительно крупным ядром и небольшим количеством цитоплазмы. У млекопитающих ...

Динамические и статистические закономерности в природе
Основное содержание проблем детерминизма и причинности — это соотношение динамических и статистических закономерностей. Детерминизм — это учение об объективной закономерной взаимосвязи и взаимообусловленности явлений материального и духо ...