Результаты и обсуждение.

Страница 3

Индивидуальные производные аминокислот

Масс-спектрометрический анализ производных аминокислот

Схема

получения дейтерий-меченного бактериородопсина из H. halobium и определения степени включения дейтерия в аминокислоты белка.

В качестве примера на рис.2,а-в изображены спектры поглощения пурпурных мембран на различных стадиях очистки от каротиноидов. Как видно из рис. 2,в, спектр поглощения бактериородопсина после экстракции от каротиноидов имеет трехполосный вид: полосы на длинах волн 568 нм и 410 нм определяются наличием хромопротеида, полоса поглощения при длине волны 280 нм определяется содержанием ароматических аминокислот в полипептидной цепи этого белка. (Для чистого бактериородопсина соотношение D280/D568 равно 2:1). Согласно предложенной схеме можно получить десятки миллиграмм дейтерий-меченного бактериородопсина, переработав 200-300 мг бактериальной биомассы. Обращенно-фазовая высокоэффективная хроматография ВЭЖХ метиловых эфиров дансилпроизводных аминокислот и бензилоксикарбонильных производных аминокислот, полученных из гидролизатов бактериородопсина показала высокие степени хроматографической чистоты выделенных аминокислот и отсутствие примесей не белковой природы в гидролизатах бактериородопсина (см. ниже).

Гидролиз дейтерий-меченного бактериородопсина.

Гидролиз дейтерий-меченного бактериородопсина проводили в условиях предотвращения изотопного обмена водорода на дейтерий в ходе гидролиза и сохранения остатков триптофана в белке. Для этого были рассмотрены два альтернативных варианта проведения гидролиза- кислотный и щелочной гидролиз бактериородопсина. Кислотный гидролиз белка в стандартных условиях (6 н. HCL, 24 ч, 1100 С), как известно, приводит к полному разрушению триптофана и частичному разрушению серина, треонина и некоторых других аминокислот в белке [19], которые для наших экспериментов не играют существенной роли. Другим значительным недостатком при проведении гидролиза в HCL является изотопный обмен ароматических протонов (дейтеронов) в молекулах триптофана и тирозина [20]. Модификация метода проведения кислотного гидролиза бактериородопсина заключалась в использовании дейтерий-меченных реагентов (6 н. раствор 2НCL (в 2Н2O) ) и добавлении в реакционную смесь 3 %- ного фенола. Другой вариант гидролиза бактериородопсина заключался в использовании 4 н. раствора Ba(OH)2 (1100 C, 24 ч). В этих условиях гидролиза белка реакций изотопного обмена водорода на дейтерий в ароматических аминокислотах триптофане и тирозине не происходит, и что особенно важно - не разрушается триптофан. Оба метода гидролиза бактериородопсина показали хорошие результаты. Однако вследствие высокой гидролизующей способности гидроокиси бария и лёгкости выделения свободных аминокислот из щелочных гидролизатов путём нейтрализации гидрооксида бария серной кислотой, авторы отдали предпочтение щелочному варианту гидролиза бактериородопсина. Для последующего масс-спектрометрического анализа гидролизаты бактериородопсина обрабатывали дансилхлоридом и диазометаном (и/или карбобензоксихлоридом) с получением летучих производных аминокислот, которые затем разделяли методами обращенно-фазовой ВЭЖХ.

Рекомендуем к прочтению:

Эволюция Вселенной. Теория «Большого взрыва»
С глубокой древности и до начала XX века космос считали неизменным. Звездный мир олицетворял собой абсолютный покой, вечность и беспредельную протяженность. Открытие в 1929 году взрывообразного разбегания галактик, то есть быстрого расшир ...

Определение специфичности полученных антител
Специфичность антител на белок с м.м. 55 кДа определяли методом Вестерн-блот. Для этого выделенный из МХ печени крысы и очищенный АТФ-чувствительный К+-транспортирующий белок с м.м. 55 кДа наносили на ДДС-ПААГ электрофорез с 10%-ым ПААГ г ...

Семейство Нутриевые (Capromyidae)
Семейство нутриевые или хутиевые. Древнее обособленное семейство, представители которого напоминают громадных крыс, массой в несколько килограммов. По своему строению, однако, эти животные далеки от настоящих крыс и имеют некоторое родств ...