Результаты и обсуждение.

Страница 3

Индивидуальные производные аминокислот

Масс-спектрометрический анализ производных аминокислот

Схема

получения дейтерий-меченного бактериородопсина из H. halobium и определения степени включения дейтерия в аминокислоты белка.

В качестве примера на рис.2,а-в изображены спектры поглощения пурпурных мембран на различных стадиях очистки от каротиноидов. Как видно из рис. 2,в, спектр поглощения бактериородопсина после экстракции от каротиноидов имеет трехполосный вид: полосы на длинах волн 568 нм и 410 нм определяются наличием хромопротеида, полоса поглощения при длине волны 280 нм определяется содержанием ароматических аминокислот в полипептидной цепи этого белка. (Для чистого бактериородопсина соотношение D280/D568 равно 2:1). Согласно предложенной схеме можно получить десятки миллиграмм дейтерий-меченного бактериородопсина, переработав 200-300 мг бактериальной биомассы. Обращенно-фазовая высокоэффективная хроматография ВЭЖХ метиловых эфиров дансилпроизводных аминокислот и бензилоксикарбонильных производных аминокислот, полученных из гидролизатов бактериородопсина показала высокие степени хроматографической чистоты выделенных аминокислот и отсутствие примесей не белковой природы в гидролизатах бактериородопсина (см. ниже).

Гидролиз дейтерий-меченного бактериородопсина.

Гидролиз дейтерий-меченного бактериородопсина проводили в условиях предотвращения изотопного обмена водорода на дейтерий в ходе гидролиза и сохранения остатков триптофана в белке. Для этого были рассмотрены два альтернативных варианта проведения гидролиза- кислотный и щелочной гидролиз бактериородопсина. Кислотный гидролиз белка в стандартных условиях (6 н. HCL, 24 ч, 1100 С), как известно, приводит к полному разрушению триптофана и частичному разрушению серина, треонина и некоторых других аминокислот в белке [19], которые для наших экспериментов не играют существенной роли. Другим значительным недостатком при проведении гидролиза в HCL является изотопный обмен ароматических протонов (дейтеронов) в молекулах триптофана и тирозина [20]. Модификация метода проведения кислотного гидролиза бактериородопсина заключалась в использовании дейтерий-меченных реагентов (6 н. раствор 2НCL (в 2Н2O) ) и добавлении в реакционную смесь 3 %- ного фенола. Другой вариант гидролиза бактериородопсина заключался в использовании 4 н. раствора Ba(OH)2 (1100 C, 24 ч). В этих условиях гидролиза белка реакций изотопного обмена водорода на дейтерий в ароматических аминокислотах триптофане и тирозине не происходит, и что особенно важно - не разрушается триптофан. Оба метода гидролиза бактериородопсина показали хорошие результаты. Однако вследствие высокой гидролизующей способности гидроокиси бария и лёгкости выделения свободных аминокислот из щелочных гидролизатов путём нейтрализации гидрооксида бария серной кислотой, авторы отдали предпочтение щелочному варианту гидролиза бактериородопсина. Для последующего масс-спектрометрического анализа гидролизаты бактериородопсина обрабатывали дансилхлоридом и диазометаном (и/или карбобензоксихлоридом) с получением летучих производных аминокислот, которые затем разделяли методами обращенно-фазовой ВЭЖХ.

Рекомендуем к прочтению:

Вывод
При анализе литературы я узнал о негативных факторах городской среды обитания, об их влиянии жизнь и здоровье человека. Что же касается нашего города, то я узнал, что на городского жителя действует огромное количество негативных факторов. ...

Хром
Хром в пищевых продуктах присутствует в виде неорганических солей, которые практически не усваиваются организмом, и комплексов с органическими соединениями, адсорбция которых в кишечнике идет значительно более интенсивно. Комплексы хрома ...

Механизм мышечного сокращения
Для его понимания необходимо ознакомиться с молекулярной организацией миофибрилл – органелл, специализированных на сокращении. Это длинные тяжи, образующие продольные пучки по тысяче и более миофибрилл, которые почти полностью заполняют ц ...