Результаты и обсуждение.

Страница 3

Индивидуальные производные аминокислот

Масс-спектрометрический анализ производных аминокислот

Схема

получения дейтерий-меченного бактериородопсина из H. halobium и определения степени включения дейтерия в аминокислоты белка.

В качестве примера на рис.2,а-в изображены спектры поглощения пурпурных мембран на различных стадиях очистки от каротиноидов. Как видно из рис. 2,в, спектр поглощения бактериородопсина после экстракции от каротиноидов имеет трехполосный вид: полосы на длинах волн 568 нм и 410 нм определяются наличием хромопротеида, полоса поглощения при длине волны 280 нм определяется содержанием ароматических аминокислот в полипептидной цепи этого белка. (Для чистого бактериородопсина соотношение D280/D568 равно 2:1). Согласно предложенной схеме можно получить десятки миллиграмм дейтерий-меченного бактериородопсина, переработав 200-300 мг бактериальной биомассы. Обращенно-фазовая высокоэффективная хроматография ВЭЖХ метиловых эфиров дансилпроизводных аминокислот и бензилоксикарбонильных производных аминокислот, полученных из гидролизатов бактериородопсина показала высокие степени хроматографической чистоты выделенных аминокислот и отсутствие примесей не белковой природы в гидролизатах бактериородопсина (см. ниже).

Гидролиз дейтерий-меченного бактериородопсина.

Гидролиз дейтерий-меченного бактериородопсина проводили в условиях предотвращения изотопного обмена водорода на дейтерий в ходе гидролиза и сохранения остатков триптофана в белке. Для этого были рассмотрены два альтернативных варианта проведения гидролиза- кислотный и щелочной гидролиз бактериородопсина. Кислотный гидролиз белка в стандартных условиях (6 н. HCL, 24 ч, 1100 С), как известно, приводит к полному разрушению триптофана и частичному разрушению серина, треонина и некоторых других аминокислот в белке [19], которые для наших экспериментов не играют существенной роли. Другим значительным недостатком при проведении гидролиза в HCL является изотопный обмен ароматических протонов (дейтеронов) в молекулах триптофана и тирозина [20]. Модификация метода проведения кислотного гидролиза бактериородопсина заключалась в использовании дейтерий-меченных реагентов (6 н. раствор 2НCL (в 2Н2O) ) и добавлении в реакционную смесь 3 %- ного фенола. Другой вариант гидролиза бактериородопсина заключался в использовании 4 н. раствора Ba(OH)2 (1100 C, 24 ч). В этих условиях гидролиза белка реакций изотопного обмена водорода на дейтерий в ароматических аминокислотах триптофане и тирозине не происходит, и что особенно важно - не разрушается триптофан. Оба метода гидролиза бактериородопсина показали хорошие результаты. Однако вследствие высокой гидролизующей способности гидроокиси бария и лёгкости выделения свободных аминокислот из щелочных гидролизатов путём нейтрализации гидрооксида бария серной кислотой, авторы отдали предпочтение щелочному варианту гидролиза бактериородопсина. Для последующего масс-спектрометрического анализа гидролизаты бактериородопсина обрабатывали дансилхлоридом и диазометаном (и/или карбобензоксихлоридом) с получением летучих производных аминокислот, которые затем разделяли методами обращенно-фазовой ВЭЖХ.

Рекомендуем к прочтению:

Неравномерное движение, привести уравнение
Уравнение передвижения материальной точки с постоянным ускорением: Y(t) = y0 + v0t + , Где у –координата, у0- начальная координата; v0 - начальная скорость, а - ускорение, t – время ...

История клонирования
Началось все с открытия яйцеклетки в 1883 году немецким цитологом О.Хертвигом, когда было установлено, что в процессе оплодотворения равноправно участвуют мужские и женские клетки. Первые шаги к клонированию животных были предприняты око ...

Получение плазмид
Наиболее распространенным методом генной инженерии является метод получения рекомбинантных, то естьсодержащих чужеродный ген, плазмид. Каждая бактерия помимо основной, не покидающей клетку молекулы ДНК (5-6 млн. пар нуклеотидов), может с ...