Результаты и обсуждение.
Страница 1

Получение дейтерий-меченного бактериородопсина

. Выбор способа получения бактериородопсина был определен целью исследования, связанной с изучением принципиальной возможности получения дейтерий-меченных препаратов бактериородопсина в препаративных количествах. При выборе L-[2,3,4,5,6-2H5]-фенилаланина, L-[3,5-2H2]-тирозина и L-[2,4,5,6,7-2H5] -триптофана в качестве источников изотопных меток, авторы учитывали важность этих аминокислот в функционировании бактериородопсина, стабильность дейтерий-меченных аналогов указанных аминокислот к (1H-2H) обмену в водной среде в условиях культивирования, а также возможность их детектирования методами масс-спектрометрии. Кривые, отражающие динамику роста штамма H. halobium ЕТ 1001 на пептоновой среде (1), обычной синтетической среде(2) и синтетической среде (3), содержащей дейтерий-меченные аналоги аминокислот L-Phe, L-Tyr и L-Trp представлены на рис. 1. Как видно из рис.1, рост H. halobium ЕТ 1001 на пептоновой среде происходит лучше чем на синтетической, однако для получения дейтерий-меченного бактериородопсина пептоновая среда не подходит ввиду наличия в ней немеченных аминокислот. Поэтому пептоновая среда была заменена на синтетическую среду, в которую добавляли дейтерий-меченные аналоги ароматических аминокислот.

Способ получения дейтерий-меченного бактериородопсина представлен на схеме. Основными этапами при получении дейтерированных препаратов бактериородопсина было: культивирование штамма H.halobium ЕТ 1001 на средах, содержащих дейтерий-меченные аналоги ароматических аминокислот, разрушение клеток и получение суспензии пурпурных мембран, очистка суспензии пурпурных мембран от обломков клеток и клеточной ДНК, очистка от каротиноидов, солюбилизация белка в додецилсульфате натрия (ДСН) и осаждение конечного продукта метанолом (см. схему). При получении пурпурных мембран, клетки обрабатывали дезоксирибонуклеазой, для того чтобы разрушить клеточную ДНК. Вследствие того, что препараты пурпурных мембран содержат примеси каротиноидов и обломки клеточных стенок, было необходимо применять специальные методы очистки и выделения белка. При выделении фракции белков из бактериальных объектов необходимо учитывать наличие в них небелковых примесей. В случае богатых белками штаммов сравнительно небольшим количеством примесных соединений в них часто пренебрегают, используя в качестве белковой фракции остаток после исчерпывающего отделения пигментов и липидов экстракцией органическими растворителями. В специальных случаях для получения фракции индивидуальных белков следует прибегать к их осаждению и очистке [18]. Выделение мембранного белка заключается в его солюбилизации в растворе детергента и последующим осаждении белка. Для этого пурпурные мембраны суспендировали в растворе ДСН. Выбор ДСН в качестве детергента в данном случае оправдан, так как бактериородопсин является интегральным белком. Выделение бактериородопсина после отделения осколков клеточных стенок из раствора ДСН достигали, осаждая белок метанолом. Наиболее трудоемкой была стадия очистки бактериородопсина от каротиноидов, которая приводила к значительным потерям хромопротеида. Для этого был использован метод низкотемпературной экстракции каротиноидов ацетоном.

Страницы: 1 2 3 4 5


Рекомендуем к прочтению:

Естествознание в XVIII-XIX вв.
В ХVIII в. естествознание остается в целом механистическим. Физика, выделившись из натурфилософии, была нацелена главным образом на количественные исследования отдельных явлений, установление отдельных экспериментальных фактов, выявление ...

Биосинтез белка
В обмене веществ организма ведущая роль принадлежит белкам и нуклеиновым кислотам. Белковые вещества составляют основу всех жизненно важных структур клетки, они входят в состав цитоплазмы. Белки обладают необычайно высокой реакционной спо ...

Изучение структурной организации митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала
Изучение структурной организации митоКАТФ, учитывая его существенную физиологическую роль, особенно при гипоксии, является актуальной проблемой. Как было сказано в «Обзоре литературы», японские ученые полагают, что по структуре он близок ...