Условия эксперимента.
Страница 2

Выделение бактериородопсина

. Препараты пурпурных мембран (50 мг) солюбилизировали в 2 мл 0,5%-ного раствора додецилсульфата натрия (ДСН) в Н2О, выдерживали в течении 8-10 часов при 220 С, затем центрифугировали (7000 об/мин, 5 мин). Осадок отделяли, к супернатанту добавляли 5-ти кратный избыток метанола, выдерживали при 00 С в течении 12-14 часов и центрифугировали (13000 об/мин, 10 мин). Остатки ДСН удаляли, промывая осадок белка дист. водой. Выход бактериородопсина составил 20 мг.

Гидролиз бактериородопсина

. Гидролиз бактериородопсина проводили двумя методами: (А)-кислотным и (В)-щелочным гидролизом. Для этого белок делили на две равные порции по 10 мг и гидролизовали в запаянных стеклянных ампулах в 30-ти кратном избытке гидролизирующего агента (24 ч, 1100 С): (А)- в 6 н. 2НCL (в 2Н2O ) с 3%-ным (по весу) фенолом и в (В) - 4 н. Ba(OH)2. После этого гидролизат, полученный в условиях (А) упаривали в роторном испарителе при 400 С. Остатки дейтеро-соляной кислоты удаляли путем выдерживания в эксикаторе над твердым NaOH. После проведения гидролиза (В), реакционную смесь суспендировали в одном объёме горячей дистиллированной воды и нейтрализовали 2 н. раствором H2SO4 до рН 7,0. Выпавший осадок сульфата бария отделяли центрифугированием (10000 об/мин, 5 мин), супернатант декантировали и упаривали в роторном испарителе при 400 С. Гидролизаты бактериородопсина, полученные в условиях (А) и (В), высушенные до постоянной массы, обрабатывали дансилхлоридом и диазометаном (или карбобензоксихлоридом).

Получение дансиламинокислот гидролизатов бактериородопсина

. К 10 мг высушенных гидролизатов бактериородопсина в 2 мл 2 м. NaHCO3 (2 10-4 моль) рН 9-10 дробными порциями при перемешивании добавляли 16 мг (5,9 10-5 моль) дансилхлорида в 4 мл ацетона. Реакционную смесь выдерживали при перемешивании при 400 С в течении часа, затем подкисляли 2 н. раствором HCL до рН 3 и экстрагировали этилацетатом (3 раза по 5 мл.). Объединенный экстракт промывали дист. водой до значения рН 7,0, сушили безводным сульфатом натрия, растворитель удаляли при 10 мм. рт. ст.

Получение метиловых эфиров дансиламинокислот гидролизатов бактериородопсина

. К 20 мл 40 %-ного КОН в 40 мл эфира добавляли 3 г влажной нитрозометилмочевины и перемешивали на водяной бане со льдом в течении 15-20 мин. После интенсивного газовыделения эфирный слой отделяли и промывали ледяной водой до рН 7,0, сушили безводным NaSO4 и обрабатывали им препараты дансилпроизводных аминокислот в составе гидролизатов бактериородопсина.

Бензилоксикарбонильные производные аминокислот получали реакцией Шоттен-Баумана по методике, указанной в работе [16].

Тонкослойную хроматографию (ТСХ) производных аминокислот проводили на пластинках “Silufol UV-254” (Чехо-Словакия) в системах: (A)-хлороформ-метанол-уксусная кислота (10:1:0,3) для бензилоксикарбонильных производных аминокислот и (Б)-хлороформ-метанол-ацетон (7:1:1) для метиловых эфиров дансиламинокислот. Аналитическое и препаративное разделение карбобензоксипроизводных аминокислот и метиловых эфиров дансиламинокислот в составе гидролизатов бактериородопсина проводили методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на жидкостном хроматографе “Knauer” (ФРГ), снабженным насосом “Knauer”, УФ-детектором “2563” и интегратором “С-R 3A” (Shimadzy, Япония). Использовали колонки: гиперсил ODS, 5 мкм, 3 250 мм, силасорб С18, 12 мкм, 10 250 мм. Элюирование проводили в системе растворителей по двум вариантам: (А)- вода-трифторуксусная кислота (100/0,1-0,5 об/об) и (В)- ацетонитрил-трифторуксусная кислота (100/0,1-0,5 об/об) при различных градиентных режимах, как описано в работе [17]. Бензилоксикарбонильные производные аминокислот детектировали по поглощению при 254 нм. Метиловые эфиры дансил-аминокислот детектировали по флуоресценции в УФ-свете.

Страницы: 1 2 3


Рекомендуем к прочтению:

Креатинфосфатный путь образования АТФ
Анаэробные пути ресинтеза АТФ являются дополнительными способами образования АТФ в тех случаях, когда основной путь получения АТФ – аэробный – не может обеспечить мышечную деятельность необходимым количеством энергии. Это бывает на первых ...

Строение и эволюция галактик
В конце XIX века границы разведанной Вселенной раздвинулись настолько, что включили в себя Галактику. Многие думали тогда, что эта огромная звездная система и есть вся Вселенная в целом. Из чего же состоит Вселенная? Хорошо видимая на но ...

Плутон
У Плутона сильно вытянутая и наклоненная орбита; в перигелии он приближается к Солнцу на 29,6 а.е. и удаляется в афелии на 49,3 а.е. В 1989 Плутон прошел перигелий; с 1979 по 1999 он был ближе к Солнцу, чем Нептун. Однако из-за большого н ...