Условия эксперимента.
Страница 1

В работе использовали соли квалификации “х.ч”., DL-аминокислоты (Reanal, Венгрия), аденозин-и уридин-5-монофосфаты (Sigma, США.), панкреотическую телячью дезоксирибонуклеазу 1 (Fluka Chemie AG, Швейцария), додецилсульфат натрия (ДСН) (Chemapol, Чехо-Словакия). L-[2,3,4,5,6-2H5]-фенилаланин (90 ат.% 2Н), L-[3,5-2H2]-тирозин (96 ат.% 2Н) и L-[2,4,5,6,7-2H5]-триптофан (98 ат.% 2Н) (способы получения указаны в работах [ 11,12]), были предоставлены доц. кафедры биотехнологии Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова к.х.н. А.Б. Пшеничниковой. Для получения производных аминокислот использовали N-диметиламинонафталин-5-сульфохлорид (дансилхлорид) (Sigma, США), карбобензоксихлорид (Войковский химзавод, РФ) и диазометан. Диазометан получали из N-нитрозометилмочевины (Merck, Германия).

Бактериальные штаммы и питательные среды

. Объектом исследования служил пигментированный штамм галофильных бактерий Halobacterium halobium ЕТ 1001. Штамм был получен из коллекции культур микроорганизмов Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова. Штамм поддерживали на пептоновой среде с 2%-ным агаром [13].

Для получения немеченного бактериородопсина использовали синтетическую среду, содержащую 18 аминокислот (количества компонентов приведены в г/л): (DL-аланин 0,43, L-аргинин 0,4, DL-аспарагиновая кислота 0,45, L-цистеин 0,05, L-глутаминовая кислота 1,3, L-глицин 0,06, DL-гистидин 0,3, DL-изолейцин 0,44, L-лейцин 0,8, L-лизин 0,85, DL-метионин 0,37, DL-фенилаланин 0,26, L-пролин 0,05, DL-серин 0,61, DL-треонин 0,5, L-тирозин 0,2, DL-триптофан 0,5, DL-валин 1), нуклеотиды (аденозин-5-монофосфат 0,1, уридин-5 монофосфат 0,1), соли (NaCl 250, MgSO4 7H2O 20, KСl 2, NH4Cl 0,5, KNO3 0,1, KH2PO4 0,05, K2HPO4 0,05, цитрат натрия 0,5, MnSO4 H2O 3 10-4, CaCL2 6H2O 0,065, ZnSO4 7H2O 4 10-5, FeSO4 7H2O 5 10-4, CuSO4 5H2O 5 10-5), глицерин 1, ростовые факторы (биотин 0,1 10-3, фолиевая кислота 10 10-3, витамин В12 0,02 10-3).

В экспериментах по введению дейтериевой метки в бактериородопсин вместо L-фенилаланина, L-тирозина и L-триптофана в синтетическую среду добавляли их дейтерированные аналоги - L-[2,3,4,5,6-2H5]-фенилаланин, L-[3,5-2H2]-тирозин, и L-[2,4,5,6,7-2H5]-триптофан.

Среды стерилизовали при 0,5 ати в течении 30-40 мин, рН доводили до величины 6,5-6,7 при помощи KOH. Посевной материал выращивали в колбах Эрленмейера, объемом 250 мл (с наполнением средой до 50 мл) при 35-37 0С в условиях интенсивной аэрации и освещении лампами дневного света ЛДС-40. После суток посевной материал в количестве 5-10 % переносили в синтетическую среду, содержащую дейтерий-меченные аналоги ароматических аминокислот и культивировали в течении 4-5 суток как и при получении посевного материала.

Выделение фракции пурпурных мембран

. Клетки осаждали на центрифуге Т-24 (Германия) (10000 об/мин, 10 мин.), осадок клеток суспендировали в дист. воде, экспонировали ультразвуком (3 экспозиции продолжительностью 5 мин) и вновь центрифугировали (10 000 об/мин, 10 мин). Пигменты удаляли обработкой ацетоном, липиды экстрагировали смесью хлороформ-метанол (2:1), растворитель декантировали. Полученный осадок клеток (100-150 мг) суспендировали в 100 мл буфера трис-HCL (рН 7,5), добавляли 1 мг дезоксирибонуклеазы 1 и инкубировали в течении 5-6 часов при 37 0С, затем разбавляли дист. водой до 200 мл, после чего инкубировали 15 часов при 40С. Осадок промывали водой с последующим отделением растворителя до получения бесцветных промывных вод. Контроль чистоты полученной суспензии пурпурных мембран (в Н2О) проводили на спектрофотометре “Beckman DU-6” (США) по соотношению полос поглощения при 280 нм/568 нм (e280=1,1 10 5 М-1см-1 [14] и e568=6,3 104 М-1 см-1 [15]).

Страницы: 1 2 3


Рекомендуем к прочтению:

Плаун темный – (Lycopodium obscurum L.)
Плаун тёмный распространен в хвойных и смешанных лесах на Дальнем Востоке, в Японии, Китае и Северной Америке. Зимостоек. Горизонтальные стебли залегают в почве, от них поднимаются наземные, прямостоячие, с торчащими спороносными колоска ...

Паразиты и болезни
Кабаны в бесснежное время большую часть суток проводят среди подлеска и высокого травянистого покрова в поисках кормов. Поэтому, большая их часть оказывается в разной степени зараженными эктопаразитами. Клещи в волосяном покрове кабанов ...

Продуктивность однолетних культур
При анализе урожайности зеленой массы однолетних культур по годам исследований установлено, что данный показатель зависел как от вида культуры, так и от фазы ее уборки (табл. 3.4.1). Таблица Урожайность зеленой массы однолетних культур, ...