Цитоскелет
Страница 3

МЕТОДЫ УСТАНОВЛЕНИЯ ТРАНСМЕМБРАННОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИПИДОВ

Химическая модификация фосфолипидов

Относительно легко подвергаются химической модификации только аминофосфолипиды, например фосфатидилсерин и фосфати-дилэтаноламин. При этом мембранный препарат с известной топологической ориентацией обрабатывают реагентом, который не проникает через бислой и ковалентно связывается со свободными аминогруппами тех аминофосфолипидов, которые находятся только на наружной поверхности мембраны. Чаще всего с этой целью используют ТНБС. Доля фосфатидилэтаноламина, вступившего в реакцию, должна служить мерой его содержания на наружной стороне мембраны. Очевидно, однако, что такой вывод неправомочен, если реакция не доходит до конца или если в ходе реакции значительное количество фосфатидилэтаноламина перемещается с внутренней стороны мембраны на наружную и становится доступным для реагента. Как правило, в реальной ситуации имеют место оба обстоятельства, что значительно осложняет интерпретацию результатов.

Предложен вариант этого подхода, предусматривающий синтез аналогов фосфолипидов с реакционноспособными сульфгидрильны-ми группами с последующим использованием непроникающих реагентов, избирательно реагирующих по SH-группам. Естественно, что эти липидные аналоги следует включать в изучаемые мембраны перед обработкой реагентами, и желательно предварительно исследовать их поведение в модельных системах.

Фосфолипидный обмен

Спонтанный обмен фосфолипидами между мембранами, как правило, протекает с пренебрежимо малой скоростью. Однако были выделены белки, называемые липидпереносящими белками, которые катализируют обмен. Эти белки чаще всего выделяют из тканей млекопитающих. Наиболее изучен белок из печени крысы, который обладает абсолютной специфичностью по отношению к фосфатидилхолину и катализирует его обмен между мембранами. Большинство других липидперенося-щих белков менее специфичны к полярным головкам липидных молекул. Это растворимые белки, которые имеют высокоаффинные места связывания фосфолипидных молекул. Механизм обмена неизвестен, однако ЛПБ можно использовать для изучения липидной асимметрии, поскольку они связывают липиды только наружной поверхности бислоя, с которыми они контактируют. Обычно мембранные везикулы инкубируют с избытком липосом, содержащих радиоактивно меченный фосфолипид, в присутствии липидперенося-щего белка. Фосфолипидный обмен со стехиометрией 1:1, который катализируется указанными белками, не приводит к изменению состава мембран, при этом степень обмениваемости фосфолипидов можно определить, измерив удельную радиоактивность мембраны. Если фосфолипид в мембране полностью доступен для обмена, то его удельная радиоактивность в липосомах и мембранах в конце эксперимента будет одинаковой. Если же изучаемый липид на внутренней стороне мембраны недоступен для обмена, то его удельная радиоактивность в мембране будет ниже, чем в липосомах. Если трансмембранная миграция протекает медленнее, чем устанавливается равновесие при обмене, то удельная радиоактивность будет возрастать во времени, и это возрастание будет отражать скорость флип-флопа. При проведении этих экспериментов необходимо отделять липосомы от изучаемых мембран; для этого обычно используют центрифугирование.

Достоинство этой методики состоит в том, что ЛПБ не проникают через мембрану, недостаток же связан с тем, что равновесие устанавливается медленно, за несколько часов или даже больше. Поэтому данная методика неприменима, когда происходит быстрая трансмембранная миграция, но ее можно использовать в сочетании с другими методами. Например, можно провести обмен радиоактивных липидов, находящихся на наружной поверхности бислоя, а затем использовать фосфолипазы для оценки скорости, с которой эти липи-ды мигрируют с наружной стороны мембраны на внутреннюю.

Фосфолипазы

Фосфолипазы — это ферменты, гидролизующие фосфолипиды по связям, указанным на рис. 4.3. Фосфолипазы представляют собой

растворимые белки, которые взаимодействуют только с наружной поверхностью бислоя и поэтому являются ценным инструментом для изучения асимметрии фосфолипидов и скорости их трансмембранной миграции. При работе с фосфолипазами следует иметь в виду два момента: 1) не все фосфолипиды на наружной стороне мембраны легко вступают в реакцию; 2) продукты реакции обычно дестабилизируют бислой. Даже если при действии фосфолипаз целостность бислоя не нарушается, скорость трансмембранной миграции фосфолипидов может существенно возрасти. Поэтому ход реакции необходимо тщательно контролировать, а выводы, сделанные на основании полученных результатов, — критически анализировать.

Страницы: 1 2 3 4 5 6 7 8


Рекомендуем к прочтению:

Специфичность и особенности химического мутагенеза.
Приоритет открытия большинства известных в настоящее время мутагенов, в том числе и наиболее эффективных, широко используемых во всем мире, - формальдегида, уретана, этиленимина, окиси этилена, диэтилсульфата, диметилсульфата - принадлежи ...

Морфологические отличия дендритов от аксонов
1. У отдельного нейрона имеется несколько дендритов, аксон всегда один. 2. Дендриты всегда короче аксона. Если размеры дендритов не превышают 1,5-2 мм, то аксоны могут достигать 1м и более. 3. Дендриты плавно отходят от тела клетки и по ...

Половые особенности кардиоваскулярной стресс-реактивности и вегетативной регуляции у крыс
Результаты экспериментов на крысах выявили значительные половые различия в чувствительности ССС к стрессорным воздействиям. Эти различия проявлялись в ситуациях умеренных стрессов и при патологических воздействиях, приводящих к развитию м ...