Методология протеолиз
Страница 3

Биология » Асимметрия мембран » Методология протеолиз

Для поверхностной модификации часто используются и другие реагенты — соли диазония, которые реагируют с боковыми цепями остатков лизина, цистеина, тироксина и гистидина, а также фотоак-тивируемые реагенты, например NAP-таурин.

В табл. 1 перечислен также ряд неполярных фотоактивируемых реагентов, которые используются для избирательной модификации аминокислотных остатков белка, контактирующих с гидрофобной областью бислоя. Эти реагенты обычно добавляют к мембранному препарату, дают им возможность накопиться в бислое и затем подвергают их фотоактивации. Преимущество образующихся при этом нитренов и карбенов состоит в том, что их реакции намного менее специфичны по сравнению с реакциями других активных частиц, так что ковалентная модификация не ограничивается боковыми цепями каких-либо определенных аминокислот. Правда, нитрены проявляют избирательность по отношению к нуклеофилам. Использование карбенов предпочтительнее, поскольку они вступают в реакцию с более высоким выходом. Для получения информации о вторичной структуре трансмембранных участков полипептидной цепи путем определения тех остатков, которые контактируют с липидами, использовали реагент ТИД. Например, спираль С бак-

Таблица 1. Некоторые реагенты, применяемые для изучения топографии мембранных белков

Підпис:

териородопсина включает метку лишь с одной стороны; это согласуется с представлением о том, что данная спираль является трансмембранной, причем ее неполярная область обращена в липидную фазу.

Локализация специфических центров

Ценную информацию иногда можно получить, определяя положение специфических центров в ряде белков. Например, места присоединения сахарных остатков в гликопротеинах плазматической мембраны всегда находятся на ее наружной поверхности, так что выявление их в полипептидной цепи имеет и топологическую ценность. Столь же информативными могут быть и данные о локализации сайтов модификации белка, например сайтов фосфорилирования, если локализация модифицирующего фермента известна. Так, в белках плазматической мембраны фосфорилированные аминокислотные остатки находятся на цитоплазматической стороне. Аналогичным образом может оказаться полезной локализация специфических мест связывания. Например, были идентифицированы места связывания бактериофага с экспонированными на поверхности клетки участками белков ОтрА и LamB наружной мембраны Е. coli; для этого использовались мутантные белки.

Генетические подходы

Возможность генетической модификации мембранных белков привела к созданию новых подходов к их топографическому анализу. Такие методы, по всей вероятности, будут применяться все шире, однако пока число удачных примеров не столь велико, чтобы судить об их надежности и универсальности. Так, в белок ОтрА методами генной инженерии были встроены в определенные места короткие пептиды, затем был проведен протеолиз и по его результатам определено, были ли участки, содержащие включенный пептид, экспонированы на поверхности клетки. Анализ мутантных вариантов позволил идентифицировать также места связывания фага и соответствующие эпитопы в белках, экспонированных на наружной стороне мембраны.

Ценные данные о топографии белков цитоплазматической мембраны Е. coli были получены и с помощью метода гибридизации белков. Гибридные белки можно сконструировать так, что их N-концевой участок будет представлен мембранным белком, а на С-конце будет находиться каталитический центр щелочной фосфатазы. Щелочная фосфатаза обычно локализуется в периплазматическом пространстве Е. coli, куда она транспортируется и где проявляет свою ферментативную активность. Синтез многих мембранных белков, по-видимому, осуществляется линейным образом, начиная с N-конца. Поэтому, если место сочленения, где начинается последовательность щелочной фосфатазы, локализовано на периплаз-матической стороне мембраны, то гибридный белок будет транспортироваться в периплазму и проявлять ферментативную активность. Если же место сочленения находится на цитоплазматической стороне, то щелочная фосфатаза в гибридном белке останется внутри клетки и будет проявлять низкую ферментативную активность. Следовательно, те места сочленения в гибридных белках, которые приводят к высокой активности щелочной фосфатазы, будут соответствовать наружным доменам мембранного белка.

Страницы: 1 2 3 


Рекомендуем к прочтению:

Строение оболочки
По строению оболочки и функциям сумки аскомицетов делят на две большие группы: прототуникатные и эутуникатные. Прототуникатные сумки имеют тонкую не дифференцированную оболочку, которая разрушается или растворяется, пассивно освобождая ас ...

Основные поля коры больших полушарий по Бродману
В коре головного мозга различают зоны - поля Бродмана (53 поля) 1-я зона - двигательная - представлена центральной извилиной и лобной зоной впереди нее - 4, 6, 8, 9 поля Бродмана. При ее раздражении - различные двигательные реакции; при ...

Строение клетки.
Клетка как целостная живая система. Клетка - это мельчайшая единица жизни, которая характеризуется определенным типом обмена веществ, самостоятельным энергетическим циклом и способностью к саморегуляции. Клетка - это открытая термодинам ...