Методология протеолиз
Страница 2

Биология » Асимметрия мембран » Методология протеолиз

Наиболее полезны те из них, которые связываются как с белком в мембране, так и с денатурированными фрагментами белка, что позволяет изучать белки после их разделения с помощью электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН. Это особенно важно для локализации места связывания антител на полипептиде. В принципе эпитоп можно локализовать с точностью до нескольких аминокислотных остатков. В качестве примеров успешного использования моноклональных антител можно привести родопсин, бактериородопсин, ацетилхолиновый рецептор и белок LamB — рецептор фага X из наружной мембраны Е. coli.

Использование антител против синтетических пептидов, соответствующих отдельным белковым фрагментам, позволяет точно выяснить, доступна ли эта область белка для связывания антитела. Если антитела, специфичные к определенной аминокислотной последовательности, связываются с нативной формой белка в мембране, то исследователь получает мощный инструмент для определения топографии белка. Этим путем можно проверять отдельные топографические модели. Примерами успешного использования данного подхода являются работы по лактозопермеазе Е. coli, микросомному цитохрому Р450 и ацетилхолиновому рецептору. К сожалению, нет гарантий, что антипептндные антитела вообще будут связываться с белком. Потенциальный центр связывания в нативном белке может находиться в такой конформации или так быть упрятанным внутри белковой глобулы, что не будет узнан антителом или доступен для него. Действительно, в некоторых случаях антипептидные антитела не связываются с белком даже после его денатурации в ДСН.

Весьма остроумным является подход к определению топографии полипептида, основанный на методах молекулярной генетики. Он состоит во введении чужеродного эпитопа в аминокислотную последовательность мембранного белка с последующим использованием антител, специфичных к этому эпитопу.

Химическая модификация

Этот подход широко использовался для локализации белков или их отдельных участков на поверхности мембраны или в ее гидрофобной области. Белок вступает в реакцию с реагентом, который может действовать лишь на одной стороне ориентированной мембраны или в ее гидрофобной сердцевине. Реагент, предназначенный для идентификации белка на поверхности мембраны, должен быть сильно полярным; он не должен адсорбироваться на мембране или накапливаться внутри ее. Для локализации же той части белка, которая находится в контакте с углеводородными хвостами липидных молекул, следует использовать очень неполярные реагенты, которые концентрируются в гидрофобной области мембраны. Артефакты, возникающие при этом подходе, чаще всего бывают связаны с тем, что реагент модифицирует белок не только в том реакционном пространстве, для которого он был предназначен. Например, реагент, направленный на модификацию поверхности мембраны, может иметь достаточно неполярный характер, чтобы проникать через мембрану и получать доступ к белкам внутреннего компартмента. Химическая модификация может также привести к повреждению мембраны и сделать ее проницаемой для того реагента, который, как ожидается, должен быть непроникающим. В табл. 1 перечислены некоторые из химических реагентов, используемые для изучения топографии мембранных белков.

Модификацию белков на поверхности мембраны часто проводят с помощью фермента лактопероксидазы, которая катализирует иодирование доступных остатков тирозина или гистидина. Поскольку реакция между I" и Н2О2 происходит в активном центре лактопероксидазы, последняя должна быть в высшей степени «векторной», т.е. локализованной только на одной стороне мембраны. Однако при определенных условиях в ходе реакции может образовываться Ь, который, проникая через мембрану, способен иодировать аминокислотные остатки на внутренней стороне мембраны. Это показывает, насколько важен строгий контроль условий протекания реакций для исключения артефактов.

Страницы: 1 2 3


Рекомендуем к прочтению:

Изучение структурной организации митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала
Изучение структурной организации митоКАТФ, учитывая его существенную физиологическую роль, особенно при гипоксии, является актуальной проблемой. Как было сказано в «Обзоре литературы», японские ученые полагают, что по структуре он близок ...

Образ жизни и поведение
Активность зависит от времени года, активности их жертв и степени преследования самих хищников человеком. Всюду более активны в прохладную погоду. Хорошо бегает. Волки избегают человека и, как правило, не нападают на него. Но деятельност ...

Выделение и очистка митоКАТФ канала
Солюблизацию КАТФ канала из МХ печени крысы проводили по методу этанольной экстракции, разработанному в нашей лаборатории [Миронова и др., 1981] с некоторыми модификациями. Полученные МХ помещали на 20 мин в гипотонический раствор (концен ...