Методология протеолиз
Страница 1

Биология » Асимметрия мембран » Методология протеолиз

Использование протеаз для определения топографии белков в ряде случаев оказалось исключительно плодотворным. Ориентированный мембранный препарат, содержащий изучаемый белок, обрабатывают протеолитическим ферментом и по местам расщепления устанавливают те участки полипептида, которые находятся с наружной стороны мембраны. Ключевым моментом является приготовление мембран с однозначной топологической ориентацией; только в этом случае возможна адекватная интерпретация результатов фрагментации изучаемого белка. Некоторые мембраны можно изучать без предварительного выделения. Однако в большинстве случаев необходима тщательная работа по получению топологически ориентированного препарата с вывернутой мембраной или с мембраной, имеющей нативную ориентацию. Такие препараты были получены для мембран эритроцитов, плазматических мембран некоторых эукариотических клеток, внутренних митохондриальных мембран, мембран саркоплазматического рети-кулума и некоторых бактериальных мембран. В отдельных случаях удается исследовать локализацию конкретного белка, специально встроенного в ориентированную мембрану реконструированных протеолипосом. В биологических мембранах помимо изучаемого белка чаще всего находятся и другие белки. Если изучаемый белок преобладает, то продукты протеолиза можно выделить и охарактеризовать. Если же он является минорным белковым компонентом, то для идентификации фрагментов приходится использовать косвенные методы, связанные с применением специфических антител или химических реагентов с последующим электрофорезом в ПААГ в присутствии ДСН. Важно убедиться в том, что те участки белка, которые недоступны для расщепления, не будут подвергаться гидролизу из-за повреждения мембран при первоначальном протеолизе. Необходимо также быстро и обратимо ингибировать протеа-зы, поскольку многие из этих ферментов остаются активными даже после добавления ДСН перед электрофорезом. Следует иметь в виду, что отсутствие расщепления еще ничего не означает, поскольку возможные места расщепления на наружной поверхности могут оказаться недоступными для протеазы из-за особенностей третичной структуры мембранного белка.

Как и в случае многих растворимых белков, протеолиз не обязательно сопровождается существенными изменениями в третичной или четвертичной структуре мембранного белка in situ, хотя его биологическая функция может быть полностью утрачена. В тех случаях, когда при расщеплении по одному или двум местам активность исчезает, с помощью протеолиза можно идентифицировать и даже выделить функционально важные домены белка.

В качестве примеров, иллюстрирующих использование протеоли-тических ферментов, можно привести белок полосы 3 эритроцитов, бактериородопсин, лактозопермеазу Е. coli и субъединицу IV цитохром с-оксидазы.

Иммунологические методы

Очень ценным инструментом для определения топографии мембранных белков являются специфичные антитела. В этом случае исследуют связывание антител с белками только в ориентированных мембранных препаратах типа мембранных везикул Е. coli. Анализ можно сделать количественным, если использовать соответствующие иммунологические методы. Места связывания можно локализовать с помощью электронной микроскопии, пометив антитела коллоидным золотом или используя золото, связанное со специфичным комплексом антиген—антитело на поверхности мембраны. Ясно, что в процессе приготовления мембранного препарата не должны разрушаться нативные топографические структуры. Чем точнее данные о местах связывания антител, тем информативнее будут эти эксперименты. Если исследовать ориентированные мембраны с нормальной или вывернутой ориентацией, то с помощью поли-клональных антител против определенного очищенного полипептидного фрагмента можно определить, имеет ли изучаемый белок участки, экспонированные на какой-либо одной стороне мембраны. Однако такие эксперименты не позволяют определить, какая часть белка экспонирована. Более детальную информацию можно получить с помощью двух подходов. Один состоит в использовании мо-ноклональных антител, а второй предусматривает применение поли-клональных антител против пептидов, соответствующих определенным областям белка.

Страницы: 1 2 3


Рекомендуем к прочтению:

Получение мембранного белка бактериородопсина, меченного дейтерием по остаткам ароматических аминокислот l-Фенилаланина, L-Тирозина и L-Триптофана.
Биосинтетически получены препараты мембранного белка бактериородопсина, в которых природные ароматические аминокислоты L-фенилаланин, L-тирозин и L-триптофан селективно замещены на их дейтерий-меченные аналоги. Это достигается путем культ ...

Эмоции и творчество. Жизнь как ценность. Эмоции и их роль в жизни человека
Эмоции – это своеобразные психологические состояния, выражающие особое отношение человека к действительности в форме непосредственных переживаний. Радость, грусть, страх, восторг, отчаяние – это разнообразные чувства и эмоции. Человек все ...

Результаты исследований. Подвидовая структура
При использовании различных эволюционных моделей в пределах вида выделяют 10 генетически обособленных групп. Ящериц, обитающих в Беларуси, авторы относят к шестой группе («chersonensis»). К этой же группе относятся ящерицы из России (Моск ...