Методология протеолиз
Страница 1

Биология » Асимметрия мембран » Методология протеолиз

Использование протеаз для определения топографии белков в ряде случаев оказалось исключительно плодотворным. Ориентированный мембранный препарат, содержащий изучаемый белок, обрабатывают протеолитическим ферментом и по местам расщепления устанавливают те участки полипептида, которые находятся с наружной стороны мембраны. Ключевым моментом является приготовление мембран с однозначной топологической ориентацией; только в этом случае возможна адекватная интерпретация результатов фрагментации изучаемого белка. Некоторые мембраны можно изучать без предварительного выделения. Однако в большинстве случаев необходима тщательная работа по получению топологически ориентированного препарата с вывернутой мембраной или с мембраной, имеющей нативную ориентацию. Такие препараты были получены для мембран эритроцитов, плазматических мембран некоторых эукариотических клеток, внутренних митохондриальных мембран, мембран саркоплазматического рети-кулума и некоторых бактериальных мембран. В отдельных случаях удается исследовать локализацию конкретного белка, специально встроенного в ориентированную мембрану реконструированных протеолипосом. В биологических мембранах помимо изучаемого белка чаще всего находятся и другие белки. Если изучаемый белок преобладает, то продукты протеолиза можно выделить и охарактеризовать. Если же он является минорным белковым компонентом, то для идентификации фрагментов приходится использовать косвенные методы, связанные с применением специфических антител или химических реагентов с последующим электрофорезом в ПААГ в присутствии ДСН. Важно убедиться в том, что те участки белка, которые недоступны для расщепления, не будут подвергаться гидролизу из-за повреждения мембран при первоначальном протеолизе. Необходимо также быстро и обратимо ингибировать протеа-зы, поскольку многие из этих ферментов остаются активными даже после добавления ДСН перед электрофорезом. Следует иметь в виду, что отсутствие расщепления еще ничего не означает, поскольку возможные места расщепления на наружной поверхности могут оказаться недоступными для протеазы из-за особенностей третичной структуры мембранного белка.

Как и в случае многих растворимых белков, протеолиз не обязательно сопровождается существенными изменениями в третичной или четвертичной структуре мембранного белка in situ, хотя его биологическая функция может быть полностью утрачена. В тех случаях, когда при расщеплении по одному или двум местам активность исчезает, с помощью протеолиза можно идентифицировать и даже выделить функционально важные домены белка.

В качестве примеров, иллюстрирующих использование протеоли-тических ферментов, можно привести белок полосы 3 эритроцитов, бактериородопсин, лактозопермеазу Е. coli и субъединицу IV цитохром с-оксидазы.

Иммунологические методы

Очень ценным инструментом для определения топографии мембранных белков являются специфичные антитела. В этом случае исследуют связывание антител с белками только в ориентированных мембранных препаратах типа мембранных везикул Е. coli. Анализ можно сделать количественным, если использовать соответствующие иммунологические методы. Места связывания можно локализовать с помощью электронной микроскопии, пометив антитела коллоидным золотом или используя золото, связанное со специфичным комплексом антиген—антитело на поверхности мембраны. Ясно, что в процессе приготовления мембранного препарата не должны разрушаться нативные топографические структуры. Чем точнее данные о местах связывания антител, тем информативнее будут эти эксперименты. Если исследовать ориентированные мембраны с нормальной или вывернутой ориентацией, то с помощью поли-клональных антител против определенного очищенного полипептидного фрагмента можно определить, имеет ли изучаемый белок участки, экспонированные на какой-либо одной стороне мембраны. Однако такие эксперименты не позволяют определить, какая часть белка экспонирована. Более детальную информацию можно получить с помощью двух подходов. Один состоит в использовании мо-ноклональных антител, а второй предусматривает применение поли-клональных антител против пептидов, соответствующих определенным областям белка.

Страницы: 1 2 3


Рекомендуем к прочтению:

Функции дендритов
Хотелось бы отметить, что основные трудности, с которыми сталкивается исследователь при изучении функции дендритов, - это отсутствие сведений о свойствах мембраны дендрита (в отличие от мембраны тела нейрона) из-за невозможности введения ...

Этика науки
Наука как область человеческой деятельности погружена в ценностное измерение: для ученого высшей ценностью является истина и все, что к ней ведет, различного рода эмпирические и теоретические методы. В сообществе ученых высоко ценятся так ...

Описание воздушной экосистемы
Невозможно представить себе воздух без птиц, но они питаются мелкими насекомыми, причем иногда не всеми подряд. Если исчезает вид съедобных насекомых, то погибают птицы, им питающиеся. Соответственно погибают какие-то змеи или хищные птиц ...