Практические аспекты автоматического секвенирования
Страница 2

Биология » Секвенирование дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) » Практические аспекты автоматического секвенирования

Во-первых отметим, что в процессе секвенирования матричная ДНК должна все время оставаться строго однонитевой, без возможных «шпилек» — локальных двунитевых участков, образующихся в силу наличия в этой ДНК близко расположенных, пусть небольших, но комплементарных последовательностей. То же самое относится и к меченым отрезкам ДНК в процессе их разделения электрофорезом. Как мы увидим ниже, в процессе комплементарного синтеза по методу Сэнджера (он повторяется многократно — в несколько циклов) такая опасность не возникает, так как в каждом цикле имеется стадия предварительной полной денатурации при температуре 96°С, а само копирование осуществляется при температуре 60°С. Но электрофорез приходится проводить в сильно денатурирующей среде: 80% -ном растворе формамида, содержащим 5 mM раствор ЭДТА Во-вторых, следует озаботиться тем, чтобы при электрофорезе количество флюоресцентно меченого материала в каждой полосе (даже такой, в которой содержится наименьшее число отрезков ДНК) было достаточным для надежной регистрации. Вместе с тем, этого желательно добиться без чрезмерного расходования исходного материала ДНК, который обычно дефицитен.

Поэтому реакцию ограниченного (включением дидезоксирибонуклеотида) матричного синтеза на том реальном количестве секвенируемой ДНК, которое направляется в эксперимент, повторяют многократно. Это делается точно так же, как в рассмотренной ранее симметричной ПЦР-реакции. Но с тем отличием, что используется только один, начальный праймер («асимметричная ПЦР-реакция»). Этап элонгации заканчивается по достижении конца матрицы (если он не был остановлен раньше). Комплементарный синтез от второго праймера в обратном направлении здесь не фигурирует.

Подобно тому, как это описано в главе 6, здесь готовят 20 мкл инкубационной смеси, в которой содержится: одно или двуните-вая нить ДНК секвенируемого фрагмента (в последнем случае будет копироваться только одна из нитей — та, для которой синтезирован праймер), избыточное количество 4-х нормальных дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, ограниченное количество 4-х флюоресцентных дидезоксирибонуклеозидтрифосфатов, термостабильная Taq ДНК-полимераза и в достаточном количестве синтетический праймер (все это в буфере с MgClg). Инкубационная смесь прогревается предварительно в тонкостенной полипропиленовой пробирочке емкостью в 0,2 или 0,5 мл при 96 °С для полной денатурации ДНК. Затем ее помещают во встроенный в прибор термоблок, где автоматически осуществляется 25 последовательных циклов, каждый из которых состоит из следующих, очень быстро сменяющих друг друга термических экспозиций:

— 10 секунд при 96 °С,

— 5 секунд при 50 °С,

— 4 минуты при 60°С.

Экспозиция при 96°С освобождает однонитевые матричные молекулы секвенируемой ДНК от новосинтезированных укороченных копий своей последовательности вместе с праймерами и Taq ДНК-полимеразой.

При 50 °С новые молекулы праймера гибридизуются с начальными участками освободившихся матриц. Вслед за ними на эти матрицы садятся и молекулы Taq ДНК-полимеразы.

В течение 4-х минут они ведут комплементарный синтез ДНК вплоть до момента случайного включения флюоресцентно меченого дидезоксирибонуклеотида.

Количество копий при таком однонаправленном синтезе не увеличивается многократно, как при симметричной ПЦР-реакции с двумя праймерами, а возрастает в лучшем случае всего в 25 раз — по числу циклов. Однако и этого оказывается достаточно для того, чтобы ограничить количество исходно вносимой ДНК 0,2 или 0,5 микрограммами (соответственно для однонитевой или двунитевой молекулы). В интересах реальной ориентировки, не мешает заметить, что для фрагмента двунитевой ДНК длиной в 1000 пар нуклеотидов в 0,5 мкг содержится более 1011 копий этого фрагмента. В каждом из циклов ПЦР-реакции все они снова и снова выступают в качестве матриц для случайным образом укороченных копирований. Это обеспечивает в конце концов достаточное число одинаковых по длине отрезков флюоресцентномеченой ДНК в любой полосе электрофоретического разделения.

Впрочем, во избежание флюоресцентного фона смесь этих отрезков следует очистить от неиспользованных меченых дидезоксинулеозидтрифосфатов. С этой целью новосинтезированные отрезки ДНК (вместе с исходными, немеченными матрицами) осаждают добавлением 1 мл 70%-го этанола и центрифугированием в микропробирках на 1,5 мл. Осадок растворяют в 4 мкл 80%-ного формамида с ЭДТА, прогревают при 96°С 2 минуты и в количестве 2 мкл вносят на старт трека пластины ПААГ.

Страницы: 1 2 


Рекомендуем к прочтению:

Естественно - научная картина мира.
Научная картина мира это – множество теорий в совокупности описывающих известный человеку природный мир, целостная система представлений об общих принципах и законах устройства мироздания. Специальные картины мира как особая форма теоретич ...

Характеристика места исследования
Сбор материала производился с середины июля до середины сентября в окрестностях г. Мозыря Гомельской области. За исследуемый период было отловлено 32 особи в двух точках сбора: 25 особей на злаковом лугу между р. Припять и старицей Мерляв ...

Продукт одного вида как субстрат для другого
В условиях класса IIб (табл. 1) роль лимитирующего субстрата для одного вида играет продукт, образуемый другим видом. Примером может служить рост пропионовокислых бактерий на молочной кислоте, полученной при росте стрептококков на лактозе ...