Практические аспекты автоматического секвенирования
Страница 1

Биология » Секвенирование дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) » Практические аспекты автоматического секвенирования

Первый вопрос, требующий прояснения — как быть с синтезом праймера, если начало секвенируемого фрагмента ДНК неизвестно. Ответа может быть два. Первый (тривиальный) — каким-то другим способом определить начальную последовательность секвенируемой ДНК. Второй — присоединить к этой ДНК, перед ее началом, с помощью естественной сахаро-фосфатной связи другую короткую, но хорошо известную последовательность нуклео-тидов. Синтезировать праймер по ней, на нее же его посадить и таким образом заставить ДНК-полимеразу считывать интересующую нас матрицу с первого нуклеотида. Оба варианта решения проблемы можно найти в уже знакомом нам материале:

1. Выяснение начальной последовательности секвенируемого фрагмента ДНК

а) Если о нем ничего неизвестно, то можно воспользоваться «устаревшим» методом Максама и Гилберта, который для первых десятков нуклеотидов достаточно быстро дает вполне надежные сведения.

б) В случае, если нас интересует секвенирование определенного гена, направляющего биосинтез вполне конкретного белка известной структуры, и если есть основание полагать, что этот ген (или хотя бы его начало) входит в состав обследуемого фрагмента ДНК. А значит и такой же длины начальную последовательность дезоксирибонуклеотидов соответствующего гена. Синтезированный праймер в этом случае просто воспроизведет расшифрованную часть иРНК.

2. Присоединение к началу секвенируемого фрагмента известной последовательности ДНК для синтеза праймера по ней.

Эту операцию мы уже, по существу говоря, проделывали, когда рассматривали возможность встраивания фрагментов чужеродной ДНК, длиною в тысячи нуклеотидов, в плазмиды. Полная последовательность нуклеотидов для множества плазмид (находящихся в продаже) хорошо известна. Таким образом мы можем естественным образом связать начало (и конец) секвенируемого фрагмента ДНК с известной последовательностью нуклеотидов плазмиды.

Встает вопрос: как узнать точно в какое место плазмиды включился наш фрагмент и как его потом «вырезать» обратно вместе с известным, ему предшествующим куском плазмиды — достаточным по своим размерам для посадки на него надежного праймера? Для ответа на этот вопрос следует вспомнить о существовании (и доступности на рынке) плазмид с «поликлоновым сайтом», насчитывающим несколько десятков пар оснований, искусственно синтезированном так, чтобы содержать в себе «сайты узнавания» для многих рестриктаз.

Для решения нашей задачи надо подобрать две рестриктазы, сайты узнавания которых в пределах поликлонового сайта отстояли бы друг от друга достаточно далеко, на расстояние, большее, чем длина будущего праймера секвенирования. Одна рестриктаза, сайт узнавания которой находился бы в «конце» поликлонового сайта (если мы определились с направлением будущего секвенирования), должна послужить для встраивания подлежащего секвенированию фрагмента ДНК. Вторая — для его последующего вырезания из плазмиды вместе с участком поликлонового сайта разделявшим сайты узнавания обеих рестриктаз. Вся последовательность нуклеотидов на этом участке известна и потому синтезировать комплементарный к нему праймер не представит труда.

Последующее секвенирование таким образом удлиненного фрагмента нашей ДНК либо начнется с его первого нуклеотида, либо с нескольких предшествующих нуклеотидов, относящихся к копированию присоединенного участка поликлонового сайта. Эти нуклеотиды легко узнать и отделить от последовательности самого исследуемого фрагмента ДНК.

Естественно, что ввиду такой определенности ситуации, фирмы-поставщики плазмид с поликлоновыми сайтами предлагают и готовые праймеры (обычно 18-членные), которые они вправе называть «универсальными», ибо они пригодны для секвенирования любых фрагментов ДНК, таким образом подготовленных.

В последнее время для умножения количества секвенируемой ДНК клонированием и создания места посадки праймера стали широко использовать бактериофаг М13. Это — нитевидный фаг, содержащий однонитевую, полностью расшифрованную ДНК. В нее, с помощью рестриктаз, точно так же, как в плазмиду можно встроить чужеродную ДНК. Попадая в клетку E.coli этот фаг приобретает двунитевую структуру и таким образом размножается в клетке («репликативная форма») до более чем 100 копий. Во время деления клетки продолжает размножаться и фаговая ДНК. Но одновременно с этим клетка E.coli (не погибая!) выбрасывает в питательную среду готовые фаговые частицы опять в виде однонитевой ДНК, одетой белком. После удаления E.coli центрифугированием, свободные фаги обрабатывают фенолом и получают однонитевую ДНК фага вместе с изначально встроенным в нее фрагментом чужеродной ДНК. Разобравшись таким образом с проблемой праймера, займемся другими важными практическими аспектами секвенирования ДНК.

Страницы: 1 2


Рекомендуем к прочтению:

Эпоха Возрождения: революция в мировоззрении и науке. Предпосылки классической науки
Научная революция, которая произошла в эпоху Возрождения в XV–XVI веках и подготовила возникновение классического естествознания, была обусловлена всем ходом социокультурных преобразований Западной Европы. Становление капиталистических от ...

Автономная нервная система
Автономная (вегетативная) нервная система обеспечивает регуляцию внутренних органов, усиливая или ослабляя их деятельность, осуществляет адаптивно-трофическую функцию, регулирует уровень метаболизма (обмен веществ) в органах и тканях. Ав ...

Задание № 1
Бактерии освоили все среды жизни. Они встречаются в атмосфере, литосфере, гидросфере, в организмах людей, животных и растений. Клетки их очень мелкие - от 0,1 до 10 мкм. По форме клетки могут быть сферические (кокки), палочковидные (баци ...