Автоматическое секвенирование (принцип)

Биология » Секвенирование дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) » Автоматическое секвенирование (принцип)

Переход к автоматическому секвенированию требовал в первую очередь проведения электрофореза всех четырех семейств отрезков ДНК в одном треке. Как уже отмечалось, установление относительного расположения четырех полос, расположенных в разных треках и отличающихся по длине всего на один нуклеотид, затруднительно. Логика визуальной оценки ситуации человеком может ввести коррективы в указанную ранее возможность неодинаковости условий разделения в разных треках. Наверное, этой логике можно « обучить « и компьютер, но это сильно усложнит его программу и ее надежность трудно предсказать.

Между тем в обоих методах переход к электрофорезу в одном треке с использованием радиоактивной метки невозможен. Для идентификации значения каждой полосы потребовалось бы четыре различных радиоактивных изотопа. Допустим, что это были бы доступные для биологических применений ^^ 14C, ^S и 32?. Различие этих изотопов может проявить себя только в степени почернения рентгеновской пленки. Но, во-первых, энергия р-излучения двух из этих изотопов (^С и ^S) почти одинаковы, а, во-вторых, степень почернения будет зависеть еще от одного, вовсе неизвестного фактора — количества отрезков ДНК, оказавшихся случайно одинаковыми по длине и потому суммирующих свое излучение в одной полосе. (Не забудем, что исходно для секвенирования мы имеем не один, а великое множество одинаковых фрагментов ДНК, независимо друг от друга копируемых в условиях случайных обрывов этого процесса.)

Разрешение проблемы было найдено использованием для идентификации полос в геле флюоресценции вместо радиоактивности. На основе дихлорородамина были разработаны четыре флюоресцентных красителя разных цветов, с максимами излучения при 544, 569, 597 и 622 тц, лежащими в зеленой, желто-зеленой, оранжевой и красной областях спектра и легко разделимыми в спектрофотометре. Авторам удалось связать эти красители с четырьмя дидезоксирибонуклетидами. Таким образом при лазерном облучении геля каждая полоса в методе Сенджера при электрофорезе в одном треке заявляла о своей специфичности соответствующим цветом излучения.

Разумеется, каждая полоса в геле, в силу своей конечной ширины и некой кривой распределения вещества по этой ширине, испускала свет флюоресценции тоже в виде некоего колоколообразного пика интенсивности света, растянутого в направлении электрофореза. В нижних своих частях эти пики могли перекрываться (как перекрывались своими границами и соответствующие полосы в геле). Но вершины пиков хорошо отделялись друг от друга, и это позволяло прямо по этим вершинам определять порядковый номер каждого нуклеотида. А его индивидуальность — по цвету пика.


Рекомендуем к прочтению:

Витамины против инфекций
Витамин С повышает сопротивляемость организма инфекционным заболеваниям. Убеждают в этом следующие опыты. Разным группам морских свинок в течение месяца давали" разные дозы витамина С. Через месяц их заражали дифтерией. Оказалось, чт ...

Строение оболочки
По строению оболочки и функциям сумки аскомицетов делят на две большие группы: прототуникатные и эутуникатные. Прототуникатные сумки имеют тонкую не дифференцированную оболочку, которая разрушается или растворяется, пассивно освобождая ас ...

Ареал обитания ласки обыкновенной
Распространен этот зверь очень широко. Его ареал занимает всю Европу, острова Средиземного моря, Азорские острова, Алжир, Марокко, Египет, Малую Азию, север Ирака, Ирана, Афганистана, Монголии и Китая, Корейский полуостров, Японию и север ...