Автоматическое секвенирование (принцип)

Биология » Секвенирование дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) » Автоматическое секвенирование (принцип)

Переход к автоматическому секвенированию требовал в первую очередь проведения электрофореза всех четырех семейств отрезков ДНК в одном треке. Как уже отмечалось, установление относительного расположения четырех полос, расположенных в разных треках и отличающихся по длине всего на один нуклеотид, затруднительно. Логика визуальной оценки ситуации человеком может ввести коррективы в указанную ранее возможность неодинаковости условий разделения в разных треках. Наверное, этой логике можно « обучить « и компьютер, но это сильно усложнит его программу и ее надежность трудно предсказать.

Между тем в обоих методах переход к электрофорезу в одном треке с использованием радиоактивной метки невозможен. Для идентификации значения каждой полосы потребовалось бы четыре различных радиоактивных изотопа. Допустим, что это были бы доступные для биологических применений ^^ 14C, ^S и 32?. Различие этих изотопов может проявить себя только в степени почернения рентгеновской пленки. Но, во-первых, энергия р-излучения двух из этих изотопов (^С и ^S) почти одинаковы, а, во-вторых, степень почернения будет зависеть еще от одного, вовсе неизвестного фактора — количества отрезков ДНК, оказавшихся случайно одинаковыми по длине и потому суммирующих свое излучение в одной полосе. (Не забудем, что исходно для секвенирования мы имеем не один, а великое множество одинаковых фрагментов ДНК, независимо друг от друга копируемых в условиях случайных обрывов этого процесса.)

Разрешение проблемы было найдено использованием для идентификации полос в геле флюоресценции вместо радиоактивности. На основе дихлорородамина были разработаны четыре флюоресцентных красителя разных цветов, с максимами излучения при 544, 569, 597 и 622 тц, лежащими в зеленой, желто-зеленой, оранжевой и красной областях спектра и легко разделимыми в спектрофотометре. Авторам удалось связать эти красители с четырьмя дидезоксирибонуклетидами. Таким образом при лазерном облучении геля каждая полоса в методе Сенджера при электрофорезе в одном треке заявляла о своей специфичности соответствующим цветом излучения.

Разумеется, каждая полоса в геле, в силу своей конечной ширины и некой кривой распределения вещества по этой ширине, испускала свет флюоресценции тоже в виде некоего колоколообразного пика интенсивности света, растянутого в направлении электрофореза. В нижних своих частях эти пики могли перекрываться (как перекрывались своими границами и соответствующие полосы в геле). Но вершины пиков хорошо отделялись друг от друга, и это позволяло прямо по этим вершинам определять порядковый номер каждого нуклеотида. А его индивидуальность — по цвету пика.


Рекомендуем к прочтению:

Взаимодействие части и целого
Взаимодействие части и целого состоит в том, что одно предполагает другое, они едины и друг без друга существовать не могут. Не бывает целого без части и наоборот: нет частей вне целого. Часть становится частью лишь в системе целого. Част ...

Фотосинтез и необходимые для него условия
Фотосинтез - процесс образования органического вещества из углекислого газа и воды на свету при участии фотосинтетических пигментов (хлорофилл у растений, бактериохлорофилл и бактериородопсин у бактерий). В современной физиологии растений ...

Очистка антител к АТФ-зависимому белку с м.м. 55 кДа
Для выделения из антисыворотки, содержащей специфические антитела, фракции иммуноглобулинов, использовали методы дробного высаливания, хроматографии и диализа [Антитела. Методы. Изд-во «Мир», 1991, т.1, с.106-107]. Антисыворотку перед вы ...