Автоматическое секвенирование (принцип)

Биология » Секвенирование дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) » Автоматическое секвенирование (принцип)

Переход к автоматическому секвенированию требовал в первую очередь проведения электрофореза всех четырех семейств отрезков ДНК в одном треке. Как уже отмечалось, установление относительного расположения четырех полос, расположенных в разных треках и отличающихся по длине всего на один нуклеотид, затруднительно. Логика визуальной оценки ситуации человеком может ввести коррективы в указанную ранее возможность неодинаковости условий разделения в разных треках. Наверное, этой логике можно « обучить « и компьютер, но это сильно усложнит его программу и ее надежность трудно предсказать.

Между тем в обоих методах переход к электрофорезу в одном треке с использованием радиоактивной метки невозможен. Для идентификации значения каждой полосы потребовалось бы четыре различных радиоактивных изотопа. Допустим, что это были бы доступные для биологических применений ^^ 14C, ^S и 32?. Различие этих изотопов может проявить себя только в степени почернения рентгеновской пленки. Но, во-первых, энергия р-излучения двух из этих изотопов (^С и ^S) почти одинаковы, а, во-вторых, степень почернения будет зависеть еще от одного, вовсе неизвестного фактора — количества отрезков ДНК, оказавшихся случайно одинаковыми по длине и потому суммирующих свое излучение в одной полосе. (Не забудем, что исходно для секвенирования мы имеем не один, а великое множество одинаковых фрагментов ДНК, независимо друг от друга копируемых в условиях случайных обрывов этого процесса.)

Разрешение проблемы было найдено использованием для идентификации полос в геле флюоресценции вместо радиоактивности. На основе дихлорородамина были разработаны четыре флюоресцентных красителя разных цветов, с максимами излучения при 544, 569, 597 и 622 тц, лежащими в зеленой, желто-зеленой, оранжевой и красной областях спектра и легко разделимыми в спектрофотометре. Авторам удалось связать эти красители с четырьмя дидезоксирибонуклетидами. Таким образом при лазерном облучении геля каждая полоса в методе Сенджера при электрофорезе в одном треке заявляла о своей специфичности соответствующим цветом излучения.

Разумеется, каждая полоса в геле, в силу своей конечной ширины и некой кривой распределения вещества по этой ширине, испускала свет флюоресценции тоже в виде некоего колоколообразного пика интенсивности света, растянутого в направлении электрофореза. В нижних своих частях эти пики могли перекрываться (как перекрывались своими границами и соответствующие полосы в геле). Но вершины пиков хорошо отделялись друг от друга, и это позволяло прямо по этим вершинам определять порядковый номер каждого нуклеотида. А его индивидуальность — по цвету пика.


Рекомендуем к прочтению:

Развитие зоогеографии
Зоогеография как наука в строгом смысле слова является детищем XIX в. Становление и развитие ее обусловлено накоплением фактов прежде всего в области биологии и географии и попытками разобраться в их причинах. Крупный биолог и зоогеограф ...

Ареал распространения
В Казахстане корсак встречается почти по всей территории республики, за исключением гор. Многочисленен в Акмолинской, Карагандинской, Восточно-Казахстанской. Обычен на полуострове Мангышлак и на плато Устюрт, живет и на Мугоджарах. Населя ...

Видовое разнообразие царства животных
Сколько видов животных населяет Землю? Один миллион, десять миллионов, пятьдесят? Мы этого не знаем. Научно описано, названо и внесено в каталоги свыше миллиона живых существ, Сюда входят почти все крупные, приметные для глаза и доступные ...