Первоначальные способы не автоматизированного секвенирования ДНК
Страница 1

Биология » Секвенирование дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) » Первоначальные способы не автоматизированного секвенирования ДНК

В 1977 году Максам и Гилберт предложили совершенно иной, оригинальный метод решения проблемы секвенирования. Им удалось найти химическую реакцию, которая расщепляла молекулу ДНК по месту расположения одного определенного нуклеотида. Они помечали радиоактивной меткой первый нуклеотид исследуемого однонитевого (после денатурации) фрагмента ДНК, представленного, разумеется, огромным количеством копий. Затем проводили реакцию расщепления в таких условиях, что подавляющее большинство нитей ДНК разрывалось только в одном из множества мест, где стоял избранный нуклеотид (а все эти места равноправны). После этого продукты расщепления направлялись для анализа методом электрофореза в ПААГ. Ауторадиография геля выявляла следующую картину.

Отрезки ДНК всех возможных размеров, считая от начала молекулы до известного (подвергшегося химической атаке) нуклеотида, разделились и обнаружили себя полосами почернения рентгеновской пленки. Самые короткие отрезки (в 2, 3 и даже один первый нуклеотид) ушли в геле далеко вперед. Более длинные отрезки отстали тем сильнее, чем они были длиннее. Степень почернения полос оказалась разная, поскольку число молекул ДНК, разорвавшихся в каждом из возможных мест было случайным. Но при достаточном количестве исходного материала все они были хорошо видны. «Отрезанные» части молекул, напротив, ничем себя в геле не проявляли, так как не содержали меченого нуклеотида.

Эта картина еще не несла в себе никакой информации о порядковых номерах нуклеотидов, по которым произошел разрыв. Однако аналогичные специфические реакции расщепления авторам удалось найти и для трех остальных нуклеотидов. Они смогли получить соответствующие картины разделения отрезков ДНК и для них. Затем они вели электрофоретическое разделение одновременно для всех 4-х случаев в параллельных треках одного геля. Из сопоставления положений всех полос оказалось возможным получить полную информацию о последовательности нуклеотидов в исследуемом фрагменте ДНК. Действительно, все полосы в 4-х треках должны находиться на разных уровнях, потому что длины соответствующих этим полосам отрезков ДНК будут различаться между собой хотя бы на один нуклеотид. Вместе с тем, ничего другого, кроме четырех нуклеотидов, в ДНК нет. Это означает, что совокупность всех отрезков дискретно исчерпывает все возможные удаления от начала молекулы. А следовательно, пронумеровав все полосы в геле, начиная с самой удаленной от старта, совокупно по всем четырем трекам можно получить всю нуклеотидную последовательность секвенируемого фрагмента ДНК.

Ауторадиография — метод регистрации положения радиоактивно-меченых веществ в геле путем фиксации их излучения на рентгеновской пленке. Ведь каждому номеру, оказавшемуся в любом из треков, будет соответствовать заранее известный нуклеотид, определивший место разрыва ДНК при подготовке препарата именно для этого трека.

Отметим, что метод Максама и Гилберта позволяет определить всю последовательность, начиная- с первого нуклеотида. Но представляет немалые трудности в трактовке результатов эксперимента. Ведь он требует уверенного определения чередования полос, находящихся в разных треках. В частности, и таких полос, которые соответствуют отрезкам ДНК длиною в несколько десятков, а то и сотен нуклеотидов с отличием в один нуклеотид. Между тем условия подготовки препаратов, да и самого электрофореза (например, условия теплоотвода) могут быть чуть-чуть разными для разных треков и это может спутать всю картину определения последовательности. Особенно в верхних частях пластины геля, где тесно сдвинуты полосы, соответствующие длинным отрезкам. По этой причине метод Максама и Гилберта не позволял секвенировать фрагменты ДНК крупнее, чем 200-300 нуклеотидных звеньев. Кроме того, он не поддавался автоматизации.

В том же 1977 году (чуть позже) Сенджер и сотр. предложили другой метод секвенирования ДНК. В принципе, он был во многом аналогичен описанному выше методу. Здесь тоже удавалось получить четыре набора отрезков ДНК всех возможных размеров, радиоактивно меченых и заканчивающихся на одном из четырех нуклеотидов. Их точно так же разделяли электрофорезом в 4-х параллельных треках ПААГ, получали четыре «лестницы» полос почернения после ауторадиографии и совокупным анализом последовательности полос в них устанавливали последовательность нуклеотидов в исследуемом фрагменте ДНК. Впрочем, не совсем всю последовательность. Первые несколько нуклеотидов при этом могли остаться не определенными по причине, которая станет ясна из дальнейшего.

Страницы: 1 2 3


Рекомендуем к прочтению:

Море - первичная среда развития жизни
Ранние этапы развития жизни на Земле. Вместе с другими планетами солнечной системы Земля образовалась, как предполагают, 5-7 млрд. лет назад. Многие сотни миллионов лет условия, необходимые для жизни, отсутствовали. Это была звездная эра ...

Генетический код и его свойства
Необходимость кодирования структуры белков линейной последовательности нуклеотидов мРНК и ДНК продиктованы тем, что в ходе трансляции: · Нет соответствия между числом номеров в матрице мРНК и продукте – синтезируемом белке; · Отсутств ...

Основные концепции химии. Химия как наука, ее предмет и проблемы
Важнейшим разделом современного естествознания является химия. Она играет большую роль в решении наиболее актуальных и перспективных проблем современного общества. К их числу относят: · Синтез новых веществ и композиций, необходимых для ...