Получение плазмид
Страница 1

Наиболее распространенным методом генной инженерии является метод получения рекомбинантных, то естьсодержащих чужеродный ген, плазмид.

Каждая бактерия помимо основной, не покидающей клетку молекулы ДНК (5-6 млн. пар нуклеотидов), может содержать несколько различных плазмид, которыми она обменивается с другими бактериями.

Плазмиды являются автономными генетическими элементами, реплицирующимися (то есть размножающимися) в бактериальной клетке не в то же время, что основная молекула ДНК. Хотя на долю плазмид приходится лишь небольшая часть клеточной ДНК, именно они несут такие жизненно важные для бактерии гены, как гены лекарственной устойчивости. Разные плазмиды содержат разные гены устойчивости к антибактериальным препаратам.

Плазмидные векторы, как правило, создают методом генной инженерии, так как природные (немодифицированные) плазмиды лишены ряда обязательных для «высококачественнного вектора» свойств:

- небольшого размера, так как эффективность переноса экзогенной ДНК в E.coli снижается при длине плазмиды более 15 тысяч пар нуклеотидов;

- наличие сайта рестрикции, в который осуществлена вставка;

- наличия одного или более селективных генетических мркеров для идентификации реципиентных клеток, несущих рекомбинантную ДНК.

Для получения рекомбинантной плазмиды ДНК одной из плазмид расщепляется выбранной рестриктазой. Ген, который нужно ввести в бактериальную клетку, расщепляют из ДНК хромосом человека с помощью рестриктазы, поэтому его «липкие» концы являются комплементарными нуклеотидным последовательностям на концах плазмид.

Ферментом лигазой «склеивают» оба куска ДНК в результате получается рекомбинантная кольцевая плазмида, которую вводят в бактерию E. coli. Все потомки этой бактерии (клоны) содержат в плазмидах чужеродный ген. Весь этот процесс называют клонированием.

Вводят плазмиды в соматические клетки с помощью химических реагентов, повышающих проницаемость клеточной оболочки. В частности, чтобы обеспечить проникновение в клетки плазмидной ДНК, их обрабатывают ледяным раствором кальция хлорида, затем выдерживают при 42°С в течение 1,5 минут. Эта обработка приводит к локальному разрушению клеточной стенки. Максимальная частота трансформации -10-3, то есть на каждую тысячу клеток приходится одна трансформированная. Частота трансформации не бывает 100%-й, затем используют схемы отбора, позволяющие идентифицировать трансформированные клетки [2].

В качестве маркеров плазмида может содержать гены, определяющие устойчивость бактерии к антибиотикам. Вставка чужеродного (донорного) гена в маркерный ген приводит к инактивации последнего. Это позволяет отличить трансформированные клетки, получившие векторную плазмиду (утратившие устойчивость к антибиотику), от клеток, получивших рекомбинантную молекулу (сохранивших устойчивость к одному, но утративших устойчивость к другому антибиотику). Этот прием называется инактивацией маркера вставки.

Для отбора трансформированных клеток, содержащих рекомбинантную ДНК (гибридную плазмиду), проводят тестирование на резистентность к определенным антибиотикам. Например, клетки, несущие гибридную плазмиду, устойчивы в ампициллину, но чувствительны к тетрациклину (в маркерный ген которого и внедрена донорная ДНК).

Процесс разделения геномной ДНК на клонируемые элементы и введения этих элементов в клетки-хозяева называется созданием геномной библиотеки (банка клонов, банка генов).

Страницы: 1 2


Рекомендуем к прочтению:

Мейоз
В ядрах незрелых половых клеток также, как и ядрах соматических клеток, все хромосомы парные, набор хромосом двойной (2 n), диплоидный. В процессе созревания половых клеток происходит редукционное деление (мейоз), при котором число хромос ...

Жизнь как ценность. Биоэтика
Биоэтика представляет собой новый раздел современной профессиональной этики и означает применение понятий и норм общечеловеческой морали к сфере экспериментальной и теоретической деятельности в биологии и медицине. Ее появление обусловлен ...

Что такое раздражимость, возбудимость, возбуждение? Каковы признаки возбуждения? Что такое раздражители? Какие бывают раздражители? Что такое порог раздражения? Что такое торможение?
Нервная система объединяет и согласует деятельность всех систем организма, в результате чего организм способен правильно реагировать на изменение внешней и внутренней среды. Нервная система состоит из центральной и периферической. В центр ...