Введение рекомбинатных молекул ДНК в клетки
Страница 1

Генная инженерия » Введение рекомбинатных молекул ДНК в клетки

После смыкания интересующего фрагмента ДНК (гена) с генетическим вектором с помощью ДНК-лигазы образованные реком-бинантные молекулы вводят в клетки с целью добиться их репликации (за счет генетического вектора) и увеличения количества копий. Наиболее популярным способом введения в клетки рекомбинантных молекул ДНК, в которых вектором служит плазмида, является трансформация Е. coli. С этой целью бактериальные клетки предварительно обрабатывают кальцием или рубидием (ионами) для того, чтобы они стали «компетентными» в восприятии рекомбинантной ДНК.

Чтобы повысить частоту проникновения ДНК в клетки, используют метод электропорации, заключающийся в кратком экспонировании клеток в интенсивном электрическом поле. Эта обработка создает полости в мембранах клеток, что способствует лучшему восприятию клетками ДНК- После введения рекомбинантных молекул ДНК в бактерии последние высевают на МПА, обогащенный антибиотиками для селекции желаемых клеток, т. е. клеток, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК. Частота трансформации является невысокой. Обычно один трансформант возникает на 106 высеянных клеток. Если же вектор является фаговым, то прибегают к трансфекции клеток (бактерий или дрожжей) фагом. Что касается соматических клеток животных, то их трансфекцию осуществляют ДНК в присутствии химических веществ, облегчающих прохождение ДНК через плазматические мембраны. Возможны также прямые микроинъекции ДНК в овоциты лягушек, в культивируемые соматические клетки и в эмбрионы млекопитающих.

Важнейшим моментом, связанным с молекулярным клониро-ванием, является поиск способа, позволяющего установить, действительно ли клонируемый фрагмент включился в вектор и вместе с вектором, образовав рекомбинантную молекулу ДНК, вошел в клетки. Если речь идет о бактериальных клетках, то один из способов основан на учете инсерционной инактивации плазмидного (векторного) гена резистентности. Например, в плазмидном векторе pBR322, детерминирующем резистентность к ампициллину и тетрациклину, единственный сайт для рестриктазы Pst I находится в локусе, занимаемом геном резистентности к ампициллину. Pst I —плавление на этом сайте генерирует липкие концы, позволяющие лигирование клонируемого фрагмента с векторной ДНК. Однако при этом плазмидный (векторный) ген ампициллинрезис-тентности инактивируется, тогда как ген тетрациклинрезистентнос-ти на векторе остается интактным. Именно, ген тетрациклинрезис-тентности и используется для селекции клеток, трансформируемых рекомбинантными молекулами ДНК. Чтобы убедиться, что клетки выросших колоний на среде с тетрациклином действительно содержат рекомбинантные молекулы ДНК, их проверяют с помощью так называемого «спот-теста» на паре чашек с плотной средой, одна их которых содержит ам-пициллин, тогда как другая лишена этого антибиотика. Клонируемые ДНК содержатся лишь в трансформантах, резистентных к тетрациклину Что касается трансформантов, резистентных одновременно к ампициллину и тетрациклину (АрТс), то они содержат плазмидные (векторные) молекулы, которые спонтанно приобрели кольцевую форму без включения в них чужеродной (клонируемой) ДНК. Другой способ обнаружения инсерции чужеродных (клонируемых) фрагментов в плазмидный вектор основан на использовании вектора, содержащего ген (3-га-лактозидазы. Инсерция чужеродной ДНК в этот ген неизбежно инактивирует синтез р-галактозидаза, что может быть обнаружено посевом трансформированных клеток на среду, которая содержит субстраты р-галактозидазы. Эта среда позволяет селекцию окрашенных колоний клеток.

Страницы: 1 2


Рекомендуем к прочтению:

Дыхательный центр
Человек дышит ритмично. С первого и до последнего часа жизни ритм дыхания у него не нарушается, меняется лишь его частота. Новорожденный ребенок 60 раз в минуту совершает дыхательное движение, пятилетний — 25; с 15—16 лет частота дыхания ...

Ферментативные системы нейронов и нейроглии
Особенности протекания метаболических процессов в нейрональных и нейроглиальных клетках наиболее отчетливо проявляются при изучении активности ферментных систем, под контролем которых они находятся. Ранние работы по исследованию активност ...

Сорго
Сорго зовут "растительным верблюдом" за способность долго переносить недостаток воды. Поэтому в засушли вых районах Африки (кое-где уже 5 тыс. лет) лепешки из сорго - основной хлеб местного населения. В Китае сорго называют &quo ...