Введение рекомбинатных молекул ДНК в клетки
Страница 1

Генная инженерия » Введение рекомбинатных молекул ДНК в клетки

После смыкания интересующего фрагмента ДНК (гена) с генетическим вектором с помощью ДНК-лигазы образованные реком-бинантные молекулы вводят в клетки с целью добиться их репликации (за счет генетического вектора) и увеличения количества копий. Наиболее популярным способом введения в клетки рекомбинантных молекул ДНК, в которых вектором служит плазмида, является трансформация Е. coli. С этой целью бактериальные клетки предварительно обрабатывают кальцием или рубидием (ионами) для того, чтобы они стали «компетентными» в восприятии рекомбинантной ДНК.

Чтобы повысить частоту проникновения ДНК в клетки, используют метод электропорации, заключающийся в кратком экспонировании клеток в интенсивном электрическом поле. Эта обработка создает полости в мембранах клеток, что способствует лучшему восприятию клетками ДНК- После введения рекомбинантных молекул ДНК в бактерии последние высевают на МПА, обогащенный антибиотиками для селекции желаемых клеток, т. е. клеток, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК. Частота трансформации является невысокой. Обычно один трансформант возникает на 106 высеянных клеток. Если же вектор является фаговым, то прибегают к трансфекции клеток (бактерий или дрожжей) фагом. Что касается соматических клеток животных, то их трансфекцию осуществляют ДНК в присутствии химических веществ, облегчающих прохождение ДНК через плазматические мембраны. Возможны также прямые микроинъекции ДНК в овоциты лягушек, в культивируемые соматические клетки и в эмбрионы млекопитающих.

Важнейшим моментом, связанным с молекулярным клониро-ванием, является поиск способа, позволяющего установить, действительно ли клонируемый фрагмент включился в вектор и вместе с вектором, образовав рекомбинантную молекулу ДНК, вошел в клетки. Если речь идет о бактериальных клетках, то один из способов основан на учете инсерционной инактивации плазмидного (векторного) гена резистентности. Например, в плазмидном векторе pBR322, детерминирующем резистентность к ампициллину и тетрациклину, единственный сайт для рестриктазы Pst I находится в локусе, занимаемом геном резистентности к ампициллину. Pst I —плавление на этом сайте генерирует липкие концы, позволяющие лигирование клонируемого фрагмента с векторной ДНК. Однако при этом плазмидный (векторный) ген ампициллинрезис-тентности инактивируется, тогда как ген тетрациклинрезистентнос-ти на векторе остается интактным. Именно, ген тетрациклинрезис-тентности и используется для селекции клеток, трансформируемых рекомбинантными молекулами ДНК. Чтобы убедиться, что клетки выросших колоний на среде с тетрациклином действительно содержат рекомбинантные молекулы ДНК, их проверяют с помощью так называемого «спот-теста» на паре чашек с плотной средой, одна их которых содержит ам-пициллин, тогда как другая лишена этого антибиотика. Клонируемые ДНК содержатся лишь в трансформантах, резистентных к тетрациклину Что касается трансформантов, резистентных одновременно к ампициллину и тетрациклину (АрТс), то они содержат плазмидные (векторные) молекулы, которые спонтанно приобрели кольцевую форму без включения в них чужеродной (клонируемой) ДНК. Другой способ обнаружения инсерции чужеродных (клонируемых) фрагментов в плазмидный вектор основан на использовании вектора, содержащего ген (3-га-лактозидазы. Инсерция чужеродной ДНК в этот ген неизбежно инактивирует синтез р-галактозидаза, что может быть обнаружено посевом трансформированных клеток на среду, которая содержит субстраты р-галактозидазы. Эта среда позволяет селекцию окрашенных колоний клеток.

Страницы: 1 2


Рекомендуем к прочтению:

Гаметогенез. Сперматогенез
Семенник состоит из многочисленных канальцев. На поперечном разрезе через каналец видно, что его стенка имеет несколько слоев клеток. Они представляют собой последовательные стадии развития сперматозоидов. Наружный слой составляют сперма ...

Нервное волокно расширяется, сужается, ветвится и кончается
В 1964 г. в Ереване проходил очередной Всесоюзный физиологический съезд. Один из авторов этой книги докладывал на съезде первые результаты и программу исследований, связанных с геометрическим подходом. Среди слушателей был Б.И. Ходоров, с ...

Учёные, которые внесли вклад в развитие селекции и генетики
1) Г. Мендель Этот немецкий учёный заложил основы современной генетики, установив в 1865 году принцип дискретности (прерывности), наследовании признаков и свойств организмов. Также он доказал метод скрещивания (на примере гороха) и обосн ...