Конструирование рекомбинантных молекул ДНК

Генная инженерия » Конструирование рекомбинантных молекул ДНК

Непосредственное конструирование рекомбинантных молекул ДНК следует после того, как получены рестрикты исследуемой ДНК и векторной ДНК. Оно заключается в смыкании сегментов-рест-риктов исследуемой ДНК с рестриктом векторной ДНК, которая в результате рестрикции превращается из кольцевой в линейную ДНК.

Чтобы сомкнуть фрагменты исследуемой ДНК с ДНК-вектора, используют ДНК-лигазу Лигирование будет успешным, если смыкаемые структуры обладают 3'-гидроксил и 5'-фосфатной группами и если эти группы расположены соответствующим образом одна относительно другой. Фрагменты объединяются через их «липкие» концы в результате са-мокомплементарности. При высоких концентрациях фрагментов последние время от времени становятся в правильное положение (напротив друг друга). Многие ре-стриктазы, такие как Eco R I, продуцируют «липкие» концы, состоящие из 4-х оснований. Процесс лигирования «липких» концов, состоящих из четырех оснований, происходит при пониженной температуре (до 12°С).

Если при рестрикции образуются фрагменты без «липких» концов, то их «насильственно» конвертируют в молекулы с «липкими» концами, используя фермент трансферазу. Этот фермент добавляет нуклеотиды к 3'-концу ДНК. На одном фрагменте может быть добавлен поли-А-хвост, на другом — поли-Т-хвост. Для генерации любых желаемых концов ДНК используют также так называемую полимеразную цепную реакцию (ПНР). Принцип ПЦР основан на денатурации выделенной из клеток ДНК и «отжиге» ее с добавлением к ренатурирующимся цепям ДНК-олигонуклеотидов, состоящих из 15—20 нуклеотидов каждый. Эти олигонуклеотиды должны быть комплементарны последовательностям в целях, разделенных расстояниями в 50-2000 нуклеотидов. Будучи «затравкой» для синтеза ДНК in vitro, они позволяют ДНК-полимеразе копировать те участки, которые находятся между «затравками». Это копирование дает большое количество копий изучаемого фрагмента ДНК.


Рекомендуем к прочтению:

Проводящие ткани. Образование, значение, функции
Проводящие ткани растений - ткани, служащие для проведения по растению воды и минеральных веществ, поглощённых из почвы, и органических веществ - продуктов фотосинтеза и др. метаболитов. Проводящие ткани состоят из удлинённых (прозенхимны ...

Методы определения суммарной биохимической активности почвенной микрофлоры
При анализе почв устанавливают не только состав их микронаселения, но и суммарную биохимическую активность почв. Одним из показателей такой активности служит нитрификационная способность почвы, характеризующая мобилизуемость азотного запа ...

Результаты посевов на жидкую среду Виноградского
При осмотре накопительных культур со средой Виноградского через несколько суток в пробирках с разными пробами почвы получены следующие результаты. Проба почвы №1 (ясеневый лес): четко видимые изменения, такие как помутнение среды, выдел ...