Конструирование рекомбинантных молекул ДНК

Генная инженерия » Конструирование рекомбинантных молекул ДНК

Непосредственное конструирование рекомбинантных молекул ДНК следует после того, как получены рестрикты исследуемой ДНК и векторной ДНК. Оно заключается в смыкании сегментов-рест-риктов исследуемой ДНК с рестриктом векторной ДНК, которая в результате рестрикции превращается из кольцевой в линейную ДНК.

Чтобы сомкнуть фрагменты исследуемой ДНК с ДНК-вектора, используют ДНК-лигазу Лигирование будет успешным, если смыкаемые структуры обладают 3'-гидроксил и 5'-фосфатной группами и если эти группы расположены соответствующим образом одна относительно другой. Фрагменты объединяются через их «липкие» концы в результате са-мокомплементарности. При высоких концентрациях фрагментов последние время от времени становятся в правильное положение (напротив друг друга). Многие ре-стриктазы, такие как Eco R I, продуцируют «липкие» концы, состоящие из 4-х оснований. Процесс лигирования «липких» концов, состоящих из четырех оснований, происходит при пониженной температуре (до 12°С).

Если при рестрикции образуются фрагменты без «липких» концов, то их «насильственно» конвертируют в молекулы с «липкими» концами, используя фермент трансферазу. Этот фермент добавляет нуклеотиды к 3'-концу ДНК. На одном фрагменте может быть добавлен поли-А-хвост, на другом — поли-Т-хвост. Для генерации любых желаемых концов ДНК используют также так называемую полимеразную цепную реакцию (ПНР). Принцип ПЦР основан на денатурации выделенной из клеток ДНК и «отжиге» ее с добавлением к ренатурирующимся цепям ДНК-олигонуклеотидов, состоящих из 15—20 нуклеотидов каждый. Эти олигонуклеотиды должны быть комплементарны последовательностям в целях, разделенных расстояниями в 50-2000 нуклеотидов. Будучи «затравкой» для синтеза ДНК in vitro, они позволяют ДНК-полимеразе копировать те участки, которые находятся между «затравками». Это копирование дает большое количество копий изучаемого фрагмента ДНК.


Рекомендуем к прочтению:

Состояние выполнения мероприятий по охране атмосферного воздуха на предприятиях.
Новочеркасск АО “Новочеркасская ГРЭС” На Новочеркасской ГРЭС выработка электроэнергии снизилась на 13,6% и составила 9553,2 млн. квт/час. Валовый выброс загрязняющих веществ по станции – 152263,867 тонны, в том числе твердые – 46410,64 ...

Как кормить русских голубых котят
Если в помете более шести котят и у кошки-матери не хватает молока, то следует применять специальные молочные смеси для подкормки котят. С трех-четырехнедельного возраста можно переходить на более твердую пищу: сухие или баночные корма, ...

Численности и динамика численности
Численность корсака в 1980–1993 гг. в Карагандинской области на охваченной учетом площади колебалась в пределах 1250–2320 особей. С 1994 года численность корсака начинает возрастать и в 1994–1998 гг. составляет от 12583 до 15400 особей. О ...