Изучение уровней включения изотопов 2Н- и 13С в секретируемые аминокислоты метилотрофных бактерий.
Страница 1

Биология » Метилотрофные бактерии - источники изотопно-меченных Н-2 и С-13 аминокислот » Изучение уровней включения изотопов 2Н- и 13С в секретируемые аминокислоты метилотрофных бактерий.

Эффективность использования дансильных и Z-производных аминокислот для масс-спектрометрических исследований была показана раннее [10, 16]. В данной работе уровни включения изотопов 2Н-и 13С в мультикомпонентные смеси аминокислот в составе культуральной жидкости и белковых гидролизатов определяли методом масс-спектрометрии электронного удара метиловых эфиров дансил-аминокислот или в виде Z-производных аминокислот после их препаративного разделения методом обращённо-фазовой ВЭЖХ.

Производные аминокислот получали прямой обработкой препаратов культуральной жидкости и гидролизатов суммарных белков биомассы карбобензоксихлоридом (ZCl) или дансилхлоридом (DnsCl) и диазометаном (CH2N2). Реакцию проводили в щелочной среде в водно-органическом растворителе в соотношении карбобензоксихлорид (дансилхлорид)-аминокислота, равным 2:1 (схема 1).

Для лизина, гистидина, тирозина, серина, треонина и цистеина наряду с монопроизводными было характерно образование ди-Z-(Dns)-производных: ди-Z,(Dns)-лизина, ди-Z,(Dns)-гистидина, О,N-ди-Z,(Dns)-тирозина, O,N-ди-Z,(Dns)-серина, O,N-ди-Z,(Dns)-треонина и N,S-ди-Z,(Dns)-цистеина (на схеме 1 эти произодные не показаны). Кроме этого, из аргинина синтезировался три-Z,(Dns)-аргинин.

Летучесть дансилпроизводных аминокислот при масс-спектрометрическом анализе повышали за счет дополнительной дериватизации по карбоксильной группе (этерификации) диазометаном. Выбор диазометана как этерифицирующего реагента был обусловлен необходимостью проведения реакции в мягких условиях, исключающих изотопный (1Н-2Н) обмен в ароматических аминокислотах.

Данные масс-спектрометрии по уровням включения стабильных изотопов 2Н-и13С в бензилоксикарбонильные производные аминокислот в пределах одинаковых концентраций тяжёлой воды в среде не отличались от таковых, полученных для метиловых эфиров дансиламинокислот (точность определения уровней изотопного включения в аминокислоты данным методом составляет +5). Данные по уровням включения 2Н-и 13С секретируемые аминокислоты исследуемых штаммов приведены в таблице 3. Для введения дейтерия в аминокислоты B. methylicum использовали минимальные среды с 2 об.% СН3ОН и различным содержанием 2Н2О в них, поскольку раннее было показано, что вклад С2Н3О2Н в уровни дейтерированности аминокислот незначителен [10].

13С-аминокислоты были получены за счёт культивирования штамма M. flagellatum на среде, содержащей обычную воду и 1 об.% к 13CH3OH. Во всех анализируемых образцах культуральной жидкости не зависимо от рода штамма присутствовали аланин, валин, лейцин (изолейцин) и фенилаланин (см. табл. 3). В культуральной жидкости M. flagellatum в дополнение вышеназванным аминокислотам также накапливался глицин.

Таблица 3.

Уровни включения 2Н и 13С в секретируемые аминокислоты B. methylicum и M. flagellatum (данные получены для Z-,и Dns-производных аминокислот)*.

Аминокислоты

Содержание 2Н2О в среде, об%

24,5 49,0 73,5 98,0

1 % 13СН3ОН

Глицин

-

-

-

-

60,0

Аланин

24,0

37,5

62,5

77,5

35,0

Валин

20,0

46,3

43,8

58,8

50,0

Лейцин (изолейцин)

15,0

47,0

46,0

51,0

38,0

фенилаланин

15,0

27,5

51,3

75,0

95,0

* Данные по включению 2Н в аминокислоты приведены для B. methylicum при росте на средах, содержащих 2 об.% CH3OH и 24,5; 49,5; 73,5; 98,0 об.% 2Н2О.

Страницы: 1 2


Рекомендуем к прочтению:

Обсуждение результатов исследования
Биохимические сдвиги, возникающие после выполнения стандартной нагрузки, обычно тем больше, чем ниже уровень тренированности спортсмена. Поэтому одинаковая по объёму стандартная работа вызывает выраженные биохимические изменения у слабо п ...

Возникновение жизни на планете
Существуют и другие представления о возникновении нашей планеты и жизни на ней. Вот одно из них. Возникновению живого вещества на Земле (и, как можно судить по аналогии, на других планетах) предшествовала довольно длительная и сложная эво ...

Сфагновые мхи. Особенности строения. Значение
Сфагновые мхи. К сфагновым (белым, или торфяным, мхам) относится примерно 350 видов, составляющих один род сфагнум. Они распространены по всему миру, но наиболее обильно представлены на верховых болотах, где господствуют над всеми остальн ...