Изучение уровней включения изотопов 2Н- и 13С в секретируемые аминокислоты метилотрофных бактерий.
Страница 1

Биология » Метилотрофные бактерии - источники изотопно-меченных Н-2 и С-13 аминокислот » Изучение уровней включения изотопов 2Н- и 13С в секретируемые аминокислоты метилотрофных бактерий.

Эффективность использования дансильных и Z-производных аминокислот для масс-спектрометрических исследований была показана раннее [10, 16]. В данной работе уровни включения изотопов 2Н-и 13С в мультикомпонентные смеси аминокислот в составе культуральной жидкости и белковых гидролизатов определяли методом масс-спектрометрии электронного удара метиловых эфиров дансил-аминокислот или в виде Z-производных аминокислот после их препаративного разделения методом обращённо-фазовой ВЭЖХ.

Производные аминокислот получали прямой обработкой препаратов культуральной жидкости и гидролизатов суммарных белков биомассы карбобензоксихлоридом (ZCl) или дансилхлоридом (DnsCl) и диазометаном (CH2N2). Реакцию проводили в щелочной среде в водно-органическом растворителе в соотношении карбобензоксихлорид (дансилхлорид)-аминокислота, равным 2:1 (схема 1).

Для лизина, гистидина, тирозина, серина, треонина и цистеина наряду с монопроизводными было характерно образование ди-Z-(Dns)-производных: ди-Z,(Dns)-лизина, ди-Z,(Dns)-гистидина, О,N-ди-Z,(Dns)-тирозина, O,N-ди-Z,(Dns)-серина, O,N-ди-Z,(Dns)-треонина и N,S-ди-Z,(Dns)-цистеина (на схеме 1 эти произодные не показаны). Кроме этого, из аргинина синтезировался три-Z,(Dns)-аргинин.

Летучесть дансилпроизводных аминокислот при масс-спектрометрическом анализе повышали за счет дополнительной дериватизации по карбоксильной группе (этерификации) диазометаном. Выбор диазометана как этерифицирующего реагента был обусловлен необходимостью проведения реакции в мягких условиях, исключающих изотопный (1Н-2Н) обмен в ароматических аминокислотах.

Данные масс-спектрометрии по уровням включения стабильных изотопов 2Н-и13С в бензилоксикарбонильные производные аминокислот в пределах одинаковых концентраций тяжёлой воды в среде не отличались от таковых, полученных для метиловых эфиров дансиламинокислот (точность определения уровней изотопного включения в аминокислоты данным методом составляет +5). Данные по уровням включения 2Н-и 13С секретируемые аминокислоты исследуемых штаммов приведены в таблице 3. Для введения дейтерия в аминокислоты B. methylicum использовали минимальные среды с 2 об.% СН3ОН и различным содержанием 2Н2О в них, поскольку раннее было показано, что вклад С2Н3О2Н в уровни дейтерированности аминокислот незначителен [10].

13С-аминокислоты были получены за счёт культивирования штамма M. flagellatum на среде, содержащей обычную воду и 1 об.% к 13CH3OH. Во всех анализируемых образцах культуральной жидкости не зависимо от рода штамма присутствовали аланин, валин, лейцин (изолейцин) и фенилаланин (см. табл. 3). В культуральной жидкости M. flagellatum в дополнение вышеназванным аминокислотам также накапливался глицин.

Таблица 3.

Уровни включения 2Н и 13С в секретируемые аминокислоты B. methylicum и M. flagellatum (данные получены для Z-,и Dns-производных аминокислот)*.

Аминокислоты

Содержание 2Н2О в среде, об%

24,5 49,0 73,5 98,0

1 % 13СН3ОН

Глицин

-

-

-

-

60,0

Аланин

24,0

37,5

62,5

77,5

35,0

Валин

20,0

46,3

43,8

58,8

50,0

Лейцин (изолейцин)

15,0

47,0

46,0

51,0

38,0

фенилаланин

15,0

27,5

51,3

75,0

95,0

* Данные по включению 2Н в аминокислоты приведены для B. methylicum при росте на средах, содержащих 2 об.% CH3OH и 24,5; 49,5; 73,5; 98,0 об.% 2Н2О.

Страницы: 1 2


Рекомендуем к прочтению:

Гаметогенез. Сперматогенез
Семенник состоит из многочисленных канальцев. На поперечном разрезе через каналец видно, что его стенка имеет несколько слоев клеток. Они представляют собой последовательные стадии развития сперматозоидов. Наружный слой составляют сперма ...

Феномен прерывистой гипобарической тренировки
В любой популяции неинбредных животных существуют особи с различной резистентностью к гипоксии [Березовский, 1978]. Индивидуальные различия в чувствительности к гипоксии и ее переносимости определяются при подъеме животных в барокамере на ...

Структурно-функциональная единица нервной системы. Морфологическая основа клеточных контактов.
Структурно-функциональная единица нервной системы. Морфологическая основа клеточных контактов. Каждый нейрон имеет расширенную центральную часть: тело-сому и отростки-дендриты и аксоны. По дендритам импульсы поступают к телу нервной клетк ...